1、海洋来源真菌 Af11 中吲哚二酮哌嗪类抗肿瘤活性成分的研究作者：赵文英 张亚鹏 朱天骄 方玉春 刘红兵 顾谦群， 朱伟明 【摘要】 对海洋来源具有抗肿瘤活性的真菌 Af11 中活性次级代谢产物进行了研究，采用活性追踪的方法从乙酸乙酯提取物中分离得到7 个含吲哚基的二酮哌嗪类化合物，根据化合物的光谱特征和理化性质分别鉴定为 cycloLtryptophylLproline (1)，NPrenylcycloLtryptophylLproline (2)，tryprostatin B (3)，demethoxyfumitremorgin C (4)，fumitremorgin C (5)，cycl
2、otryprostatins B (6)和 fumitremorgin B (7)，其中化合物 2 为新天然产物。利用丽丝胺罗丹明法，对 7 个单体化合物的抗肿瘤活性进行了初步评价。 【关键词】 海洋来源真菌 吲哚二酮哌嗪 抗肿瘤活性Studies on the indolyl diketopiperazine analogs producedABSTRACT To investigate the antitumor secondary metabolites of marinederived fungal Af11. Seven indolyl diketopiperazine compou
3、nds were isolated with bioassayguided separation procedure. The structures of these compounds were determined through extensive analysis of 1D and 2DNMR data. Their antitumor activities against K562 cell lines were preliminarily evaluated by the lissamine rhodamine B method. Compound 2 was a new nat
4、ural product.KEY WORDS Marinederived fungus; Indolyl diketopiperazine compounds; Antitumor activity由于海洋环境的特殊性，赋予生活在海洋中的真菌在生理性状和遗传背景上与陆生真菌具有显著差异，因此从海洋来源真菌代谢产物中寻找有效的抗肿瘤先导化合物引起国内、外学者的关注。经过多年的不懈努力，人们已经相继从海洋来源的真菌中分出许多结构新颖的具有抗肿瘤活性的化合物，其中以生物碱类成分居多。天然产物中的生物碱都是由氨基酸衍生而成的，其中二酮哌嗪类生物碱具有显著生理活性，如由苯丙氨酸和丝氨酸衍生的 gliot
5、oxin1是一种真菌毒素，具有很强的细胞毒活性和免疫抑制作用；喹唑酮类生物碱fumiquinozolinesAI 2是由色氨酸和邻氨基苯甲酸衍生的，具有中等强度的细胞毒活性和抗真菌活性等。近年来本实验室利用人慢性髓性白血病细胞(K562)的流式细胞术筛选模型开展了从海洋微生物中寻找新的细胞周期抑制剂和细胞凋亡诱导剂等抗肿瘤先导化合物的研究工作。从海洋样品中分离纯化了近千株微生物菌株，对其发酵产物进行活性筛选。其中从青岛近海海泥样品中分离出真菌 Af11 的发酵物显示有明显的坏死性细胞毒活性和细胞周期抑制作用，采用活性追踪的分离方法从其活性部位中分离得到个含吲哚基的二酮哌嗪类化合物。本文主要报道
6、该类化合物的提取分离、结构鉴定和抗肿瘤活性。1 材料与方法1.1 仪器与试剂质谱用 AutospecUltimaTOF 型质谱仪，核磁共振谱用日本JEOL JNMECP600 型核磁共振仪测定。分析用高效液相色谱仪：Waters公司产品Waters 600，Waters 996 二极管阵列检测器，Millennium32工作站，Capcell Pak C18 柱：(4.6mm250mm，5m) 。制备用高效液相色谱仪：日本岛津公司产品LC6AD ，SPDM20 AVP 检测器，SCL10AV 型系统控制器，Capcell Park C18 柱：(20mm250mm，5m)。柱层析及薄层层析用硅
7、胶 H(1040m)：青岛海洋化工集团公司。SephadexTM LH20 ：Pharmacia 公司。活性测试采用 K562 细胞。胎牛血清(FBS)和 RPMI1640 细胞培养基分别为 Hyclone 公司(Cat.No.STF721)和 Gibcobrl 公司产品。丽丝胺罗丹明 B(lissamine rhodamine B，SRB)为 Sigma 公司产品。1.2 菌种发酵按培养微生物的常规方法取真菌适量，接种到 PDA 琼脂固体斜面培养基上，在 28培养箱中培养 7d。用接种针挑取适量孢子和菌体，接种到含 100ml 种子培养液的 500ml 三角烧瓶中，置摇床中，在 28、120
8、r/min 条件下培养 48h，获得种子培养液。取该种子培养液适量，按 5%的接种量接种到内装 150ml 培养液的500ml 三角烧瓶中，置 28、120r/min 的摇床上发酵 7d，获得菌株的发酵培养液。1.3 菌株提取物的制备将菌株的发酵培养液离心，分为上清液和菌丝体。取上清液，用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，得上清液的乙酸乙酯萃取液。菌丝体用 80%丙酮水溶液超声破碎提取 3 次，合并提取液，减压浓缩至不含丙酮后，用乙酸乙酯萃取三次，萃取液与上清液的乙酸乙酯萃取液合并，减压浓缩至干，得到该菌株的乙酸乙酯萃取物(粗提物 35g)。1.4 活性成分的追踪分离取菌株发酵培养物的粗提物，以石
9、油醚 丙酮为洗脱溶剂系统进行减压柱层析，共得到 10 个组分。采用 K562 细胞为筛选模型，检测每个组份的活性。活性组分 Fr.6 经 Sephadex LH20 ，氯仿甲醇(11)洗脱，得 Fr.64 ，重结晶得化合物 7(39mg)。活性组分 Fr.8 经常压柱层析，用 CHCl3 洗脱，得到 5 个组分，其中 Fr.83 重结晶得化合物1(80mg)。活性组分 Fr.9 减压柱层析，以氯仿 甲醇混合溶剂为洗脱系统，得到 9 个组分。其中 Fr.96 经半制备反相高效液相色谱，乙腈水(3070，V/V)洗脱，分别得到化合物 2(5mg)、3(11mg)、4(25mg)、5(34mg)和
10、6(4.6mg)。1.5 活性测试按照文献3采用 SRB 法，结合显微镜观察细胞形态变化。2 结果与讨论2.1 化合物结构鉴定化合物 1 淡黄色结晶(氯仿)，ESIMS 给出 284M+H+伪分子离子峰，结合 1H 和 13CNMR 谱，推出分子式为 C16H17N3O2。IR 谱中给出1674 和 1652cm-1 典型的酰胺羰基吸收，与 13CNMR 中的 169.3 和165.5 处的信号相对应，提示该化合物为二氧哌嗪类。1HNMR 中显示有邻二取代的苯环(7.58d，J=8.0Hz，4H ；7.37d，J=8.0Hz，7H ；7.22td，J=8.0，1.1Hz，6H ；7.14d，J
11、=8.04，1.1Hz，5H) ；13CNMR 和 DEPT谱中给出 2 个酰胺羰基信号和苯环上的碳信号，还显示有 1 个 sp2 杂化的季碳信号(109.5)，3 个次甲基(其中 1 个 sp2 杂化)和 4 个亚甲基信号，推测结构中可能含有吲哚环。从 1H1H COSY 和 HMQC 谱推出分子中有脯氨酸残基， 结合 HMBC 谱并根据文献数据4 ，得出化合物 1 为cycloLtryptophylLproline(Fig.1, Tab.1, Tab.2)。化合物 2 黄色油状，ESIMS 给出 352M+H+、374M+Na+和390M+K+伪分子离子峰，结合 1H 和 13CNMR 谱
12、，推出分子式为C21H25N3O2。比较化合物 1 和 2 的 1H 和 13CNMR 谱，两者极其相似，2比 1 多出 2 个甲基、1 个亚甲基、1 个烯烃质子信号和 1 个 sp2 杂化季碳信号而缺少了 1 个 N 上活泼氢信号，推测其 N 上氢被 1 个异戊烯基所取代。与文献5相对照，确定该化合物为NPrenylcycloLtryptophylLproline ，2000 年SanzCervera 等曾合成出此化合物，本文首次从天然产物中分离(Fig.1, Tab.1, Tab.2)。化合物 3 白色结晶(氯仿)，ESIMS 给出 352M+H+伪分子离子峰，与化合物 2 为同分异构体，
13、分子式为 C21H25N3O2。比较 2 和 3 的 1H和 13CNMR 谱，发现 3 比 2 少了 1 个 sp2 杂化的次甲基，而多了 1 个 N上的活泼氢，并且在 2 中与 N 相连的烯丙基质子也由 4.67 向高场移至3.46。推测在化合物 2 中连在 N 上的异戊烯基转移到与 N 相邻的 2 位上。与文献对照6确定该化合物为 tryprostatin B(Fig.1, Tab.1, Tab.2)。化合物 4 白色结晶(氯仿)，ESIMS 给出 350M+H+和372M+Na+伪分子离子峰，结合 1H 和 13CNMR 谱，推出分子式为C21H23N3O2。比较化合物 4 和 3 的
14、 1H 和 13CNMR 谱，4 比 3 少了 1 个 N上的活泼氢和 1 个亚甲基(3.46)，而在 6.04 处多了 1 个次甲基信号。推测异戊烯基上的亚甲基与邻近哌嗪环上的 N 相连形成 1 个新的环。对照文献6 ，确定该化合物为 demethoxyfumitremorgin C(Fig.1, Tab.1, Tab.2)。化合物 5 为淡黄色结晶(氯仿)，ESIMS 给出 380M+H+和402M+Na+伪分子离子峰，结合 1H 和 13CNMR 谱，推出分子式为C22H25N3O3。化合物 5 的 1HNMR 信号比 4 多了 1 个甲氧基信号(3.81)，而在低场显著的 1，2 二取
15、代苯环信号被 1，2，4 三取代的苯环信号所取代，因此推测化合物 5 是化合物 4 的甲氧基衍生物。这一推测也被13CNMR 上出现的甲氧基信号(55.7)和连氧的 sp2 杂化的季碳(156.3)所证实。对照文献6确定化合物 5 为 fumitremorgin C(Fig.1, Tab.1, Tab.2)。化合物 6 白色结晶(氯仿)，ESIMS 给出 448M+Na+和462M+K+伪分子离子峰，结合 1H 和 13CNMR 谱，推出分子式为C23H27N3O5。从 13CNMR 谱上比较，化合物 6 比 5 多了 1 个甲氧基(56.595)和 1 个连氧季碳(84.7)，少了 1 个亚
16、甲基，并且次甲基向低场移了 20.2(76.8)，推测其与氧相连。其他碳谱数据基本相同。结合 1HNMR 谱数据并对照文献7 ，推出该化合物为cyclotryprostatins B(Fig.1, Tab.1, Tab.2)。化合物 7 淡黄色结晶(氯仿)，ESIMS 给出 9812M+Na+和9972M+K+伪分子离子峰，结合 1H 和 13CNMR 谱，推出分子式为C27H33N3O5。从 1H 和 13CNMR 谱上比较，化合物 7 比 6 多了 2 个甲基(C 18.0，H 1.84；C 25.3，H 1.68)、1 个亚甲基(C 41.5，H 4.52)和 1 个次甲基(C 120.
17、2，H 5.01)，1 个季碳(C 134.3)信号，其余信号基本(下转第 764 页)(上接第 页)相同，推测化合物 7 比 6 多了 1 个异戊烯基，并且 N1 上的活泼氢信号消失，所以多出的这个异戊烯基应连在 N1 上。这一推测可从 HMBC 谱上得到证实，23H与 9C 和 2C 有相关性。对照文献8确定化合物 7 为fumitremorgin B(Fig.1, Tab.1, Tab.2)。2.2 抗肿瘤生物活性测试采用 SRB 法测定了 7 个化合物的抗肿瘤活性，结果表明，化合物27 具有弱的细胞毒活性，抑制率分别为 19.7%(50g/ml)、17.4%(10g/ml)、11.5%
18、(1g/ml)、25.6%(10g/ml)、13.1%(1g/ml)、14.3%(1g/ml)；这些化合物的抗肿瘤作用在 1100g/ml 范围内不具有浓度依赖性，化合物 1 未表现出抗肿瘤活性。化合物 17 是从海洋真菌中分到的一系列由简单的环二肽衍生成的生物碱，其中化合物 27 又通过 1 经异戊烯基化衍生而成。早在 20世纪 70 年代，人们就发现这类化合物属于真菌毒素，能使实验动物产生震颤，最近这类化合物更因其独特的生理活性和特殊的化学结构受到广泛关注。Cui 等6证实这类化合物对小鼠 tsFT210 细胞有周期抑制活性，将肿瘤细胞抑制在 G2/M 期。SanzCervera 等5发现
19、这类化合物对微管聚集有抑制作用，并且芳环上的甲氧基取代对其活性有影响，甲氧基可减弱细胞毒活性而增强干扰微管的活性。本文活性测试表明，这类化合物对 K562 细胞有弱的细胞毒活性，据文献报道，色氨酸残基上的C 上的取代基为 取向的化合物的活性比 取向的活性明显增强，为证实这推测，我们将采取化学合成的方法对其结构进行改造，其构效关系正在进一步的研究中。【参考文献】1 Vigushin D M, Mirsaidi N, Brooke G, et al. Gliotoxin is a dual inhibitor of farnesyltransferase and geranylgeranyltra
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