1、海洋小单孢菌来源的轻快菌素 B FW5233的体外抗肿瘤活性【摘要】 目的 考察轻快菌素 B FW5233 的体外抗肿瘤活性。方法 采用 MTT 比色分析法、流式细胞法和高内涵药物筛选的方法检测FW5233 对肿瘤细胞株细胞生长、细胞周期、肿瘤细胞骨架蛋白、线粒体膜电位的影响。结果 FW5233 对肿瘤细胞株 K562、L929 的生长有明显抑制作用，IC50 分别为 500 和 400ng/ml。FW5233 处理后的 K562 肿瘤细胞阻滞在 G0/G1 期。FW5233 使 L929 肿瘤细胞的细胞核大小、细胞骨架纤维状肌动蛋白 FActin 量、线粒体膜电位明显减少。结论 FW5233
2、 有显著抗肿瘤活性。 【关键词】 轻快菌素； 抗肿瘤作用； 海洋小单胞菌ABSTRACT Objective To investigate the antitumor activities of rakicidin B FW5233 in vitro. Methods The inhibitory effects of the FW5233 to the proliferation, cycle, skeleton, mitochondrial membrane potential of the tumor cells were assayed by the colorimetric MTT
3、assay, flow cytometry and high content screening methods. Results FW5233 strongly inhibited the cell proliferation of K562 and L929 tumor cell lines with IC50 value of 500ng/ml and 400ng/ml, respectively. K562 cells were arrested in G0/G1 phase when treated with FW5233, which had the ability to decr
4、ease the size of nucleolus, disrupt tumor cell Factin synthesis and reduce mitochondrial membrane potential. Conclusion FW5233 exhibited potent antitumor activities.KEY WORDS Rakicidin; Antitumor; Marine Micromonospora微生物次级代谢产物是新药的重要来源。海洋微生物具有独特的代谢方式，产生的次级代谢物化学结构具有明显的复杂性和多样性，有的是陆地微生物所不具备的。海洋微生物药物的研究
5、开发工作始于 20 世纪 70 年代，在 90 年代得到很大的发展。迄今已从海洋微生物的代谢产物中分离出几百种生物活性物质，其中有些是可能有临床应用价值的抗肿瘤抗生素，如海洋放线菌产生的新型抗肿瘤抗生素lomaiviticins1和 salinosporamideA2已进入临床研究阶段。因此从海洋微生物中筛选到新型抗肿瘤抗生素的成功率相对较大。从海洋小单孢菌筛选新抗肿瘤生物活性物质过程中，我们发现了海洋小单孢菌 Micromonospora sp. FIM 02523 产生有抗肿瘤活性的脂肽类化合物 FW523，该化合物有 5 个单组分。经波谱分析和理化性质研究，发现组分 3(FW5233)
6、与轻快菌素 B(rakicidin B)同质3 。本文报道FW5233 的体外抗肿瘤活性。1 材料与方法1.1 样品 FW5233 样品(HPLC 纯度 99.8%)，福建省微生物研究所国家新药微生物筛选实验室制备；紫衫醇(paclitaxol)购自美国Sigma 公司。上述样品分别用无水乙醇配制成 1mg/ml 母液，-20备用。1.2 方法(1)FW5233 对人类红白血病肿瘤细胞株 K562 细胞生长的抑制作用 肿瘤细胞株 K562 细胞以 2105/ml 浓度加入 96 孔板，每孔100l，分别加入用完全 1640 培养液稀释的 FW5233 ，空白对照只加培养液，将培养板置 37、5
7、% CO2 培养箱培养 72h，把培养后的 96 孔板以MTT 比色分析法测定各孔在 570nm 的光吸收值 A570，计算不同浓度的FW5233 对细胞增长的抑制率。抑制率=(对照 A570 值-样品 A570 值)对照 A570 值100%(2)对人类红白血病肿瘤细胞株 K562 细胞周期的影响 对数增长期的 K562 细胞接种于 6 孔细胞培养板中，每孔细胞 1106 个，总体积4ml，加入 FW 5233 至其终浓度分别为 125、250、500 和2000ng/ml，36h 时终止培养。分别收集细胞，PBS 洗两次(1000r/min，5min)，细胞重悬于 1ml 冷 75%乙醇中
8、固定过夜，加等量的PBS 洗两次(1000r/min，5min)，加胰 RNA 酶(10mg/ml，Sigma 产品)100l，置 37 15min。加碘化丙啶(PI)溶液(PI 50g/ml，柠檬酸钠0.1%，Triton X100 0.1%)500l，4 30min，用流式细胞仪(Beckman Coulter Epics XL Cytometer)检测并分析结果。(3)对小鼠成纤维细胞 L929 细胞凋亡的影响 L929 细胞以 3000 个/孔的密度接种到胶原蛋白包被的 96 孔板上，37，5% CO2 培养箱培养24h，加入不同浓度的 FW5233 ，继续培养 24h，对照药物为紫衫
9、醇。应用美国 Cellomics 公司多指标细胞凋亡试剂盒进行测定，按试剂盒操作程序分别加入线粒体、细胞核荧光染色剂和细胞骨架纤维状肌动蛋白Factin 的荧光染色剂，使用该公司的高内涵药物筛选系统(Array Scan HCS)采集数据并进行分析4 。2 结果2.1 对肿瘤细胞凋亡及细胞周期的影响FW5233 对人类红白血病 K562 肿瘤细胞生长有很强的抑制作用(IC50 约 500ng/ml)。K562 肿瘤细胞培养液加入 FW5233 至终浓度125、250、500 和 2000ng/ml，培养 36h 时用流式细胞仪分析细胞凋亡和细胞周期。药物处理组可见明显的凋亡峰，随药物浓度增大，
10、凋亡细胞的比例增加。药物处理后的 K562 肿瘤细胞阻滞在 G0/G1 期，S 期细胞比率下降(Tab.1)。G0/G1 期的阻滞使细胞进入 S 期减少，抑制肿瘤细胞的增殖。2.2 对肿瘤细胞核、骨架蛋白、线粒体膜电位的影响应用 Cellomics 公司多指标细胞凋亡试剂盒测定，并以紫衫醇为对照药物，应用该公司的 ArrayScan HCS 系统采集数据。FW5233 对L929 肿瘤细胞生长有明显的抑制作用，IC50 为 400ng/ml(紫衫醇 IC50 500ng/ml)，表明 FW5233(rakicidin B)对肿瘤细胞生长的抑制作用浓度与对照药物紫杉醇相当。超过 1g/ml 的
11、FW5233 使 L929 肿瘤细胞的细胞核大小、细胞骨架纤维状肌动蛋白 FActin 量、线粒体膜电位均明显减少，然而紫衫醇 100ng/ml 以上使 L929 肿瘤细胞细胞核明显增大，FActin 含量增加，线粒体膜电位明显增加(Fig.1Fig.3)。以上结果说明 FW5233 与紫衫醇抗肿瘤细胞的作用机制不同，FW5233 能抑制肿瘤细胞微丝的合成，降低肿瘤细胞线粒体膜电位。3 讨论本研究表明轻快菌素 B FW5233 能明显抑制肿瘤细胞的生长，抑制肿瘤细胞微丝合成。高内涵筛选实验发现 FW5233 与轻快菌素rakicidin A、B 一样具有抗肿瘤活性，其抗肿瘤活性与紫杉醇相当，F
12、W5233 和紫衫醇对 L929 肿瘤细胞生长的 IC50 分别为 400 和500ng/ml。FW5233 能抑制肿瘤细胞 L929 的生长，使 L929 细胞核缩小、细胞骨架纤维状肌动蛋白 Factin 含量、线粒体数量及膜电位均减少。FW5233 抑制肿瘤细胞 L929 生长的作用机制与紫衫醇不同，特别是它能抑制肿瘤细胞微丝的合成并降低线粒体膜电位。抗肿瘤药物的筛选靶位很多，作用于细胞骨架微丝是其中一个靶位。微丝在多种肿瘤细胞中被大量修饰，并伴随着微丝相关调节蛋白的改变，与肿瘤细胞异常的生长特点如黏附及转移有关5，6 。以微丝及其相关调节蛋白为靶点的抗肿瘤药物对肿瘤细胞有较高的选择性，目
13、前作用于微丝的药物仅发现了不到 10 种，如来源于真菌的细胞松弛素(cytochalasin)阻止肌动蛋白聚合成微丝，具有抗肿瘤的潜能。生物碱鬼笔环肽(phalloidin)同细胞松弛素的作用相反，只与聚合的微丝结合，而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合后，抑制了微丝的解体，因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡，也具有抗肿瘤作用79 。Lantrunculins 是一类来自海洋生物的抗肿瘤药物，可与多种肿瘤细胞的微丝结合，并使之解聚，抑制肿瘤细胞增殖10 。2005 年又报道了来源于海绵的 bistheonellide A 和 phenochalasin B 是新的破坏微丝的药物11
14、 。这些作用于微丝的药物都是国外发现的，国内未进行这方面的药物筛选。我们实验首次报道海洋小单胞菌产生的轻快菌素 B FW5233 是一类具有抑制肿瘤细胞微丝合成的新化合物。FW5233 作用于肿瘤细胞的另一个靶点可能是线粒体，因为它能使肿瘤细胞线粒体膜电位下降。肿瘤细胞在凋亡早期， 即在出现细胞核凋亡征象(染色质凝聚和 DNA 片段化)前出现线粒体跨膜电位降低。一旦出现线粒体膜电位下降，即进入不可逆的凋亡过程12，13 。来自海洋软体动物的生物活性物质 lamellarin D 抗肿瘤细胞的靶点之一就是使线粒体跨膜电位下降14 。FW5233 是如何作用于肿瘤细胞微丝合成及降低线粒体膜电位而导
15、肿瘤细胞凋亡的机制有待进一步研究。【参考文献】1 He H, Ding W W, Valerie S B, et al. Lomaiviticins A and B, potent antitumor antibiotics from Micromonospora lomaivitiensis J. J Am Chem Soc,2001,123(22):53625363.2 Feling R H, Buchanan G O, Mincer T J, et al. Salinosporamide A: a highly cytotoxic proteasome inhibitor from a
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