1、本科毕业论文系列开题报告生物工程利用固相萃取液质联用技术快速筛选产毒藻种及毒素种类一、选题的背景与意义近年来，一些作为饮用水源的湖泊、水库等水体富营养化及蓝藻水华爆发已严重威胁到人民群众的饮用水安全。蓝藻水华爆发不仅造成水质下降，而且还释放出内源性藻毒素，其中微囊藻毒素MC是出现频率最高，危害最严重的藻类毒素，微囊藻毒素LRMCLR是我国富营养化水体中毒性较大的常见亚型，能强烈抑制蛋白磷酸酶1PP1和蛋白磷酸酶2APP2A的活性，具有肝脏毒性和肿瘤促进作用。除了微囊藻MICROCYSTIS外，蓝藻门中的鱼腥藻属ANABAENA、浮丝藻属PLANKTOTHRIX、束丝藻属APHANIZOMENO
2、N中的某些种类也能产生此类毒素。1996年在巴西造成100多名急性肝功能故障，7个月内至少50人死于藻毒素产生的急性效应，引起举世瞩目的关注。淡水水体中的蓝藻毒素已成为全球性的环境问题，世界各地经常发生蓝藻毒素中毒事件。由于毒素对身体及环境的危害，急需开发一种方便，快捷的方法对其进行检测，本课题采用固相萃取法，液相色谱质谱联用方法对生活中实际藻体和水样中的毒素进行定性定量分析。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的基本内容本课题采用固相萃取法对藻毒素进行提取，然后利用液相色谱质谱联用方法对藻体和水样中的毒素进行定性定量分析。拟解决问题1对实际藻种和水样进行定性定量分析的研究。2优化对液相色
3、谱质谱联用方法的开发。3摸索固相萃取法的条件和运用。三、研究的方法与技术路线技术路线淡水藻的培养研究方法1、淡水藻的培养本研究所用的藻种均为中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库FACHBCOLLECTION提供。藻种采用BG11液体培养基培养，室内温度25，光照强度为10001500LUX，光暗比为1212，每天摇瓶12次，静置培养。2、藻毒素的提取、纯化1）抽滤取1000ML水样，用045M滤膜抽滤，滤液用于测胞外毒素（EMC），滤膜上的藻细胞用于测胞内毒素（IMC）。2）胞外毒素的前处理（固相萃取）1SPEC18小柱（500MG|6ML）预活化用10ML纯甲醇去活化，再用10ML去离子
4、水平衡。21000ML滤过的水样过柱。3杂质淋洗用20ML20甲醇进行淋洗抽虑。4毒素洗脱用10ML90酸化甲醇（含01三氟乙酸）洗脱，洗脱液收集于15ML离心管中。5旋转蒸发及定容洗脱液旋转蒸发至1ML（05ML左右），用移液枪取出，甲醇定容至1ML，经针式滤器过滤，收集于15ML棕色进样品中，20下保存待测。3）胞内毒素的前处理1细胞破碎及藻毒素的提取剪碎滤膜，加入30ML15乙酸，65下水水浴10MIN，细胞超声破碎10MIN，再重复水浴、超声2次，045M滤膜抽滤，滤过的水样用于测IMC。2其余步骤同上胞外毒素步骤。色谱和质谱条件色谱HYPERSILGOLDC18色谱柱（100MM21
5、MM17M），进样量10L，柱温30，流动相为甲醇（A）、01甲酸水溶液（B）和乙腈（C），流速02ML/MIN，洗脱梯度为藻毒素的提取、纯化采用液相色谱三重四级质谱联用方法对藻体和水样中的毒素进行定性定量分析。TIMEMINMETHANOL01FORMICACIDACN04906612701814166024242245333032204831400603240060334906404906质谱采用电喷雾电离源正离子电离模式，雾化气采用氮气，喷雾电压28KV，鞘气流量30L/MIN，辅助气流量10L/MIN，离子传输毛细管温度300，扫描采用选择反应监测（SRM）模式。采集时间均为02S，碰
6、撞气采用氩气，碰撞气压力15MTORR。Q1和Q3分辨率均设定为半峰宽07DA。四、研究的总体安排与进度20109指导老师毕业论文题目下达20109201011进行文献查阅和资料收集，完成开题报告及任务书，制定具体研究计划和实验方案。201011201012实验相关原料、药品的采购和相关仪器安装。20101220113藻毒素的分离和各方面试验的进行。2011320114完成2篇外文翻译，论文撰写、提交。2011420115开题答辩。五、主要参考文献1VANAPELDOORNME,VANEGMONDHP,SPEIJERSGJA,ETALTOXINSOFCYANOBACTERIAJMOLECULA
7、RNUTRITIONANDFOODRESEARCH,2007,5117602PALUSJ,DZIUBALTOWSKAE,STANCZYKM,ETALBIOMONITORINGOFCYANOBACTERIALBLOOMSINPOLISHWATERRESERVOIRANDTHECYTOTOXICITYANDGENOTOXICITYOFSELECTEDCYANOBACTERIALEXTRACTSJINTERNATIONALJOURNALOFOCCUPATIONALMEDICINEANDENVIRONMENTALHEALTH,2007,20148653MACKINTOSHC,BEATTIEKA,KLU
8、MPPS,ETALCYANOBACTERIALMICROCYSTINLRISAPOTENTANDSPECIFICINHIBITOROFPROTEINPHOSPHATASE1AND2AFROMBOTHMAMMALSANDHIGHERPLANTSJFEBSLETTERS,1990,26421871924FALCONERIRTUMORPROMOTIONANDLIVERINJURYCAUSEDBYORALCONSUMPTIONOFCYANOBACTERIAJENVIRONMENTALTOXICOLOGYANDWATERQUALITY,1991,621771845DTILLETT,EDITTMANN,M
9、ERHARD,ETALSTRUCTURALORGANIZATIONOFMICROCYSTINBIOSYNTHESISINMICROCYSTISAERUGINOSAPCC7806ANINTEGRATEDPEPTIDEPOLYKETIDESYNTHETASESYSTEMJCHEMISTRYTWOOFTHEMAJORSERINE/THREONINEPROTEINPHOSPHATASESINVOLVEDINCELLULARREGULATIONCURROPININSTRUCBIOL,1993,39349439肖兴富,李文奇,刘娜，等富营养化水体中蓝藻毒素的危害及其控制J中国水利水电科学研究院学报,200
10、5,3211612310黄湫淇,詹平微囊藻毒素的细胞毒性及机制研究状况J预防医学情报杂志,2005,21330430611程斌,浦跃朴,尹立红藻毒素的检测与生物学效应评价的研究进展J东南大学学报医学版,2004,231576112LAWTONLA,EDWARDSC,CODDGAEXTRACTIONANDHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHICMETHODFORTHEDETERMINATIONOFMICROCYSTINSINRAWANDTREATEDWATERSJANALYST,1994,11971525153013郑力行,吴和岩,施玮高效液相色谱法测定水中微囊藻
11、毒素的含量J中国卫生检验杂志,2004,14552652714AGUETEECA,GAGOMARTNEZA,LEAO,JM,ETALHPLCANDHPCEANALYSISOFMICROCYSTINSRR,LRANDYRPRESENTINCYANOBACTERIAANDWATERBYUSINGIMMUNOAFFINITYEXTRACTIONJTALANTA,2003,59469770515JMERILUTOTCHROMATOGRAPHYOFMICROCYSTINSJANALCHIMACTA,1997,35227729816张昱,杨敏,李宗来,等液相色谱电离质谱法测定微囊藻毒素J中国给水排水,20
12、05,214949617STUARTAOEHRLE,BENSOUTHWELL,JUDYWESTRICKDETECTIONOFVARIOUSFRESHWATERCYANOBACTERIALTOXINSUSINGULTRAPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYTANDEMMASSSPECTROMETRYJTOXICON,2010,555,96597218ANJ,CARMICHAELWWUSEOFACOLORIMETRICPROTEINPHOSPHATASEINHIBITIONASSAYANDENZYMELINKEDIMMUNOSORBENTASSAYFORTHESTUDYO
13、FMICROCYSTINSANDNODULARINSJTOXICON,1994,32121495150719TUBAROA,FLORIOC,LUXICHE,ETALSUITABILITYOFTHEMTTBASEDCYTOTOXICITYASSAYTODETECTOKADAICACIDCONTAMINATIONOFMUSSELSJTOXICON,1996,34974320DRIKASM,CHOWCWK,HOUSEJ,ETALUSINGCOAGULATION,FLOCCULATION,ANDSETTLINGTOREMOVETOXICCYANOBACTERIAJJAMWATERWORKSASSOC,
14、2001,210011121戎文磊,周圣东水厂常规处理工艺去除藻毒素的研究J净水技术,2004,231L322GRUTZMACHERG,BOTTCHERG,CHORUSIREMOVALOFMICROCYSTINSBYSLOWSANDFILTRATIONJENVIRONMENTALTOXICOLOGY,2002,17438639423NEUMANNU,WECKESSERJELIMINATIONOFMICROCYSTINPEPTIDETOXINSFROMWATERBYREVERSEOSMOSISJENVIRONMENTALTOXICOLOGYANDWATERQUALITY,1998,1321431
15、4824WELKERM,STEINBERGC,JONESGRELEASEANDPERSISTENCEOFMICROCYSTININNATURALWATERSACYANOTOXINSOCCURRENCE,CAUSES,CONSEQUENCESCBERLINSPRINGER,20018310125朱光灿,吕锡武紫外微臭氧工艺降解微囊藻毒素的动力学特性J东南大学学报自然科学版,2005,35343844126赵传鹏，浦跃朴，尹立红,等溶微囊藻菌的分离与溶藻作用J东南大学学报（自然科学版），2005,354602606毕业论文文献综述生物工程藻毒素分析处理方法摘要过去几十年间蓝藻水华随着营养元素的增加
16、而频发，引发了严重的环境问题，尤其对饮用水形成了很大的威胁。微囊藻毒素是细胞内毒素，它在细胞内合成，细胞死亡后释放出来并表现出毒性藻毒素能抑制蛋白磷酸酶的活性，对生物体既能表现出急性毒性，也存在慢性毒性，经成为各国水专家广泛关注的问题。文章查阅了大量文献，详细介绍了水体中藻毒素的来源、特性及其危害，在对藻毒素的性质和分析方法进行了分析的基础上，总结了国内外一些先进的去除微囊藻毒素的技术。关键词藻毒素；分析方法；处理方法；1微囊藻毒素的来源、结构和特性11微囊藻毒素的背景及来源近年来，一些作为饮用水源的湖泊、水库等水体富营养化及蓝藻水华爆发已严重威胁到人民群众的饮用水安全1。蓝藻水华爆发不仅造成
17、水质下降，而且还释放出内源性藻毒素，其中微囊藻毒素MC是出现频率最高，危害最严重的藻类毒素2，微囊藻毒素LRMCLR是我国富营养化水体中毒性较大的常见亚型，能强烈抑制蛋白磷酸酶1PP1和蛋白磷酸酶2APP2A的活性3，具有肝脏毒性和肿瘤促进作用4。除了微囊藻（MICROCYSTIS外，蓝藻门中的鱼腥藻属ANABAENA、浮丝藻属PLANKTOTHRIX、束丝藻属APHANIZOMENON中的某些种类也能产生此类毒素。1996年在巴西造成100多名急性肝功能故障，7个月内至少50人死于藻毒素产生的急性效应，引起举世瞩目的关注。淡水水体中的蓝藻毒素已成为全球性的环境问题，世界各地经常发生蓝藻毒素中
18、毒事件。MC的产生受微囊藻的生长期、光照、温度和营养条件的影响5，生长条件改变，毒性也发生变化，环境因子可以通过作用于细胞分裂速度而控制毒素产生6。12微囊藻毒素的结构MC是一类环状七肽化合物（如图1），其中，环肽结构中含有X和Y两个可变的氨基酸基团。X和Y的不同氨基酸组合可以形成相应的MC异构体，如在LR型中，X和Y分别代表亮氨酸和精氨酸，此外，还有RR、YR等其他多种类型藻毒素。迄今，从野外或实验室培养微囊藻中已分离出近70种毒素异构体7。在已知的MC的异构体中，以MCLR的生理毒性最强是目前已知毒性仅次于二噁英的剧毒化合物。MC结构中所含共轭二烯型氨基酸，ADDA3氨基9甲氧基2,6,8
19、三甲基10苯基4,6二烯酸是表达该类毒素生理活性的最主要特征结构，分别通过形成1,2两个肽键与其他氨基酸缩合成环。除MC外，还有一类名为节球藻毒素NODULARIN的环状五肽也具有ADDA结构。13微囊藻毒素的特性MC和NODULARIN两类肝毒素主要通过生物体的胆汁酸传输系统在生物体内运输并在肝脏、肾脏及消化道组织中累积，然后通过共价键与蛋白磷酸酶结合。这种结合将直接抑制蛋白磷酸酶1和2A的活性，阻断蛋白磷酸化过程，最终导致肝脏等器官的纤维化，促发肿瘤形成。研究表明，当MC特征结构ADDA结合不等数量的氨基酸形成不同长度的肽键后，就会对蛋白磷酸酶1和2A表现出不同程度的抑制作用，即不同的毒性
20、效应8，引发乳动物肝细胞微丝分裂、破裂和出血，肝充血肿大，失血休克死亡等病症9。即使ADDA只和一个氨基酸结合形成肽键后，也会对蛋白磷酸酶起到一定的抑制作用。但未形成肽键的ADDA经生物检测，未表现出明显毒性效应。因此，ADDA结构对这两类肝毒素的毒性行为起到至关重要的作用。MC也能导致细胞的代谢紊乱，释放出大量炎性物质和细胞因子，引起机体的损伤10。2微囊藻毒素分析方法21生物分析方法（1）采用MC毒素合成酶基因MCY基因，鉴定筛选产藻毒素藻株。该法检测下限低，灵敏度高，方便快捷，可检测干藻粉、实验室培养物、无前处理的自然水样等，但不能定量和无法检测溶解的MC11。（2）采用对小鼠进行灌喂或
21、腹腔注射来鉴定藻毒素的毒性，根据其急性毒性初步筛选，粗略地判断提取物是否有毒性，然后根据毒素作用特点区分神经毒性或肝毒性，并粗略判断毒素含量，但不能鉴定藻毒素结构，该方法操作简便，可快速直观获取结果，但样品需要量大，无法精确定量。22化学分析方法化学分析法对藻毒素可进行精确的定性、定量检测，包括高效液相色谱法HPLC12、二极管阵列检测器DAD13电化学检测器联用、色谱/质谱联用法LC/MS、质谱HPLCMS、毛细管电泳CEMS、高效毛细管电泳HPCE14、气相色谱和质谱GCPMS联用及薄层色谱法TLC等。在化学检测方法中使用较多的是HPLC，HPLC一般用恒溶剂作为流动相，分离柱为ODS反相
22、柱，可以分离包括MCLR、RR、YR和其他藻毒素15，利用梯度洗脱可以分离更多的MC，然后进行紫外UV、荧光FL、化学发光CL或二极管阵列紫外检测器检测，可广泛用于MC的鉴定和定量检测。将被测毒素与标准毒素的滞留时间进行比较可对被测毒素进行鉴定，将两者的峰面积进行比较可对其进行精确定量。HPLC方法技术含量高，价格昂贵；还必须备有标准纯毒素或者某毒素在相同实验条件下的保留值。张昱等16通过固相萃取SPE富集微囊藻毒素MC，并采用液相色谱电喷雾电离质谱，HPLC/ESIMS测定水源水中的MCRR、YR和LR。固相萃取回收率在85以上，固相萃取HPLCMS法的线性检测限为05500NG/L。STU
23、ARTAOEHRLE等用改进的超高效液相色谱（UPLC）串联质谱测定方法，在八分钟内迅速而清晰的分析出了有特异性和高峰值的每一种实验藻毒素。本课题使用高效液相色谱三重四级杆质谱分析系统（HPLCQQQMS），对藻毒素研究分析，该方法灵敏、准确，方法检测限达到003NG/ML，能够满足国内外的限量要求，相对于紫外，荧光等等方法更能精确定量分析。23生物化学分析方法主要包括酶联分析法ELISA17、蛋白磷酸酶抑制分析法PPIA18、免疫检测法等，此类方法因其快速、灵敏及工作原理简单易行得以迅速发展，适合分析处理大批样品，但不能对毒素起到良好的鉴别作用，会出现假阳性反应。目前由于微囊藻毒素单克隆抗体
24、难以获得而又受到一定的限制19。3微囊藻毒素处理方法传统的水处理工艺中，混凝、沉淀过程由于管道内部湍流和滤池内压力梯度的作用可能破坏藻类细胞壁，造成藻毒素的释放20，所以传统的水处理工艺会加重藻毒素的危害。31物理法311絮凝沉淀法絮凝沉淀法是一种比较有效的去处水体中藻毒素的方法。戎文磊研究表明经生物砂滤和加氯氧化后能有效降解水中溶解性藻毒素含量，去除率平均达63左右21。GRUTZMACHER等22研究表明慢滤技术也能有效去除饮用水中细胞内毒素。312吸附法活性炭吸附是目前研究最多的一种物理去除微囊藻毒素的方法，常用的活性炭滤料为粉末活性炭PAC和颗粒活性炭GAC。多数研究表明，PAC和GA
25、C均可有效而快速（接触时间30MIN地去除水中的藻毒素。313膜虑超滤、反渗透和钠滤对藻毒素处理有良好的效果。超滤对藻毒素的去除效果可达98，反渗透能达到996，钠滤膜可完全截留水中的藻毒素23。32化学方法溶解在水中的微囊藻毒素表现出极为稳定的特性，能够在高于300高温的条件下不被破坏。但是，微囊藻毒素在色素或者腐殖质物质存在的环境下，可以被光降解24。此外，臭氧氧化也能高效快速地除去藻毒素25。33生物方法天然水体中存在有效降解微囊藻毒素的微生物，它们可以通过改变侧链活性氨基酸基团ADDA的结构或打开环状结构降低其毒性，但过程比较缓慢26。4结语水体富营养化已经成为我国湖泊污染的最主要的问
26、题，藻毒素的存在更给人们的生活环境带来了很大的威胁，我国近年来虽然对藻类的研究已经取得了很大的进步，但是分析及检测方法还有很多不完善的地方，对毒作用机制方面的认识也不是很清楚，处理方法有很多局限性，今后应对MC引起的污染状况给予足够的重视，作出相应的对策。参考文献1VANAPELDOORNME,VANEGMONDHP,SPEIJERSGJA,ETALTOXINSOFCYANOBACTERIAJMOLECULARNUTRITIONANDFOODRESEARCH,2007,5117602PALUSJ,DZIUBALTOWSKAE,STANCZYKM,ETALBIOMONITORINGOFCYANO
27、BACTERIALBLOOMSINPOLISHWATERRESERVOIRANDTHECYTOTOXICITYANDGENOTOXICITYOFSELECTEDCYANOBACTERIALEXTRACTSJINTERNATIONALJOURNALOFOCCUPATIONALMEDICINEANDENVIRONMENTALHEALTH,2007,20148653MACKINTOSHC,BEATTIEKA,KLUMPPS,ETALCYANOBACTERIALMICROCYSTINLRISAPOTENTANDSPECIFICINHIBITOROFPROTEINPHOSPHATASE1AND2AFRO
28、MBOTHMAMMALSANDHIGHERPLANTSJFEBSLETTERS,1990,26421871924FALCONERIRTUMORPROMOTIONANDLIVERINJURYCAUSEDBYORALCONSUMPTIONOFCYANOBACTERIAJENVIRONMENTALTOXICOLOGYANDWATERQUALITY,1991,621771845DTILLETT,EDITTMANN,MERHARD,ETALSTRUCTURALORGANIZATIONOFMICROCYSTINBIOSYNTHESISINMICROCYSTISAERUGINOSAPCC7806ANINTE
29、GRATEDPEPTIDEPOLYKETIDESYNTHETASESYSTEMJCHEMISTRYTWOOFTHEMAJORSERINE/THREONINEPROTEINPHOSPHATASESINVOLVEDINCELLULARREGULATIONCURROPININSTRUCBIOL,1993,39349439肖兴富,李文奇,刘娜，等富营养化水体中蓝藻毒素的危害及其控制J中国水利水电科学研究院学报,2005,3211612310黄湫淇,詹平微囊藻毒素的细胞毒性及机制研究状况J预防医学情报杂志,2005,21330430611程斌,浦跃朴,尹立红藻毒素的检测与生物学效应评价的研究进展J东南大
30、学学报医学版,2004,231576112LAWTONLA,EDWARDSC,CODDGAEXTRACTIONANDHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHICMETHODFORTHEDETERMINATIONOFMICROCYSTINSINRAWANDTREATEDWATERSJANALYST,1994,11971525153013郑力行,吴和岩,施玮高效液相色谱法测定水中微囊藻毒素的含量J中国卫生检验杂志,2004,14552652714AGUETEECA,GAGOMARTNEZA,LEAO,JM,ETALHPLCANDHPCEANALYSISOFMICROCY
31、STINSRR,LRANDYRPRESENTINCYANOBACTERIAANDWATERBYUSINGIMMUNOAFFINITYEXTRACTIONJTALANTA,2003,59469770515JMERILUTOTCHROMATOGRAPHYOFMICROCYSTINSJANALCHIMACTA,1997,35227729816张昱,杨敏,李宗来,等液相色谱电离质谱法测定微囊藻毒素J中国给水排水,2005,214949617STUARTAOEHRLE,BENSOUTHWELL,JUDYWESTRICKDETECTIONOFVARIOUSFRESHWATERCYANOBACTERIALT
32、OXINSUSINGULTRAPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYTANDEMMASSSPECTROMETRYJTOXICON,2010,555,96597218ANJ,CARMICHAELWWUSEOFACOLORIMETRICPROTEINPHOSPHATASEINHIBITIONASSAYANDENZYMELINKEDIMMUNOSORBENTASSAYFORTHESTUDYOFMICROCYSTINSANDNODULARINSJTOXICON,1994,32121495150719TUBAROA,FLORIOC,LUXICHE,ETALSUITABILITYO
33、FTHEMTTBASEDCYTOTOXICITYASSAYTODETECTOKADAICACIDCONTAMINATIONOFMUSSELSJTOXICON,1996,34974320DRIKASM,CHOWCWK,HOUSEJ,ETALUSINGCOAGULATION,FLOCCULATION,ANDSETTLINGTOREMOVETOXICCYANOBACTERIAJJAMWATERWORKSASSOC,2001,210011121戎文磊,周圣东水厂常规处理工艺去除藻毒素的研究J净水技术,2004,231L322GRUTZMACHERG,BOTTCHERG,CHORUSIREMOVALOF
34、MICROCYSTINSBYSLOWSANDFILTRATIONJENVIRONMENTALTOXICOLOGY,2002,17438639423NEUMANNU,WECKESSERJELIMINATIONOFMICROCYSTINPEPTIDETOXINSFROMWATERBYREVERSEOSMOSISJENVIRONMENTALTOXICOLOGYANDWATERQUALITY,1998,13214314824WELKERM,STEINBERGC,JONESGRELEASEANDPERSISTENCEOFMICROCYSTININNATURALWATERSACYANOTOXINSOCCU
35、RRENCE,CAUSES,CONSEQUENCESCBERLINSPRINGER,20018310125朱光灿,吕锡武紫外微臭氧工艺降解微囊藻毒素的动力学特性J东南大学学报自然科学版,2005,35343844126赵传鹏，浦跃朴，尹立红,等溶微囊藻菌的分离与溶藻作用J东南大学学报（自然科学版），2005,354602606本科毕业设计（20_届）利用固相萃取液质联用技术快速筛选产毒藻种及毒素种类目录1引言12实验221仪器和试剂222淡水藻培养和毒素预处理323标准样品的配制324色谱和质谱条件33结果与讨论431质谱离子化条件的选择和色谱分离432定量标准曲线和方法检测限833方法的回收
36、率和精密度834实际藻类和水样测定114结论11致谢12参考文献13附录错误未定义书签。摘要【摘要】对购买来的12种标准藻毒素甲醇进行定溶，然后再进行稀释，得到各个浓度的混合溶液。利用高效液相色谱三重四级杆质谱（HPLCQQQMS）对混合溶液进行分析；采用电喷雾电离源正离子模式，分别取其母离子和子离子作为目标离子进行检测。结果表明，12种藻毒素在HYPERSILGOLDC18色谱柱上得到良好分离，方法在050NG/ML浓度范围内线性相关系数高于09900，方法的最低检测限001NG/ML，得到满意的回收率在910和1058之间，相对标准偏差小于71；三种甲壳动物肌肉中蜕皮激素回收率达85791
37、2，相对标准偏差小于87。对实际培养的藻体和采集的水样进行分析，检测其藻毒素及浓度。【关键字】微囊藻毒素；回收率；高效液相色谱三重四级杆质谱（HPLCQQQMS）【ABSTRACT】AFACILEMETHODBASEDONREVERSEDPHASELIQUIDCHROMATOGRAPHYCOUPLEDWITHTRIPLEQUADRUPOLEMASSSPECTROMETRYHPLCQQQMSHASBEENESTABLISHEDFORTHEANALYSISOFTOXINMETHANOL,ACETONITRILEAND01FORMICACIDWEREUSEDASTHESOLVENTGRADIENTA
38、NDHYPERSILGOLDC18REVERSEDPHASECOLUMNWASUSEDFORSEPARATIONANDTHEMASSSPECTROMETERWASOPERATEDINPOSITIVEIONMODEUSINGSE1ECTREACTIONMONITORINGSRMFORQUANTITATIVEANALYSESTHERESULTSSHOWEDTHATTWELVETOXINSWERESEPARATEDEFFICIENTLYINTHEC18COLUMNTHELINEARITYWASSUPERIORATTHERANGEOF050NG/ML,WITHCORRELATIONCOEFFICIEN
39、TABOVE09900THELOWDETECTIONLIMITWASBELOW020NG/MLANDTHELOWQUANTITATIVELIMITWASLOWERTHAN060NG/MLTHERECOVERYOFTOXINSEXCEPTNODULARIN,ANATOXINANDCYLINDROSPERMOSPINWEREFROM597814016,WITHRSDLESSTHAN861USINGTHISMETHOD,THETYPEANDCONCENTRATIONOFTOXINS,EXTRACTEDFROMALGAEANDWATERSAMPLES,WEREDETERMINEDBYHPLCQQQ/M
40、SANALYSISTOTHE12ONTHEPURCHASEOFTHESTANDARDSETOFMICROCYSTINMETHANOLSOLUTION,ANDTHENFURTHERDILUTEDTOOBTAINAMIXEDSOLUTIONOFVARIOUSCONCENTRATIONSHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYTRIPLEQUADRUPOLEMASSSPECTROMETRYHPLCQQQMSANALYSISOFTHEMIXEDSOLUTIONBYELECTROSPRAYIONIZATIONPOSITIVEIONMODE,WERETAKENASTHEPAR
41、ENTIONANDDAUGHTERIONSTARGETIONSWEREDETECTEDTHERESULTSSHOWEDTHAT12SPECIESOFALGAETOXINSINTHEHYPERSILGOLDC18COLUMNGETGOODSEPARATION,THEMETHODINTHE050NG/MLCONCENTRATIONRANGEOFLINEARCORRELATIONCOEFFICIENTSHIGHERTHAN09900,THELOWESTMETHODDETECTIONLIMIT001NG/ML,THERECOVERYOFSATISFACTORYRATEOF910AND1058,ANDT
42、HERELATIVESTANDARDDEVIATIONLESSTHAN71THREECRUSTACEANMOLTINGHORMONEINMUSCLERECOVERYRATEOF857912,RELATIVESTANDARDDEVIATIONLESSTHAN87THEACTUALCULTUREOFALGAEANDWATERSAMPLESFORANALYSIS,DETECTIONANDCONCENTRATIONOFTHEALGAETOXIN【KEYWORDS】TOXINSHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYTRIPLEQUADRUPOLEMASSSPECTROME
43、TRYHPLCQQQ/MSQUANTITATIVEANALYSISMICROCYSTINRECOVERYHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYTRIPLEQUADRUPOLEMASSSPECTROMETRYHPLCQQQMS1引言近年来，一些作为饮用水源的湖泊、水库等水体富营养化及蓝藻水华爆发已严重威胁到人民群众的饮用水安全1。蓝藻水华爆发不仅造成水质下降，而且还释放出内源性藻毒素，其中微囊藻毒素MC是出现频率最高，危害最严重的藻类毒素2，微囊藻毒素LRMCLR是我国富营养化水体中毒性较大的常见亚型，能强烈抑制蛋白磷酸酶1PP1和蛋白磷酸酶2APP2A的活性3，
44、具有肝脏毒性和肿瘤促进作用4。除了微囊藻（MICROCYSTIS外，蓝藻门中的鱼腥藻属ANABAENA、浮丝藻属PLANKTOTHRIX、束丝藻属APHANIZOMENON中的某些种类也能产生此类毒素。1996年在巴西造成100多名急性肝功能故障，7个月内至少50人死于藻毒素产生的急性效应，引起举世瞩目的关注。淡水水体中的蓝藻毒素已成为全球性的环境问题，世界各地经常发生蓝藻毒素中毒事件。MC是一类环状七肽化合物（如图1），其中，环肽结构中含有X和Y两个可变的氨基酸基团5。X和Y的不同氨基酸组合可以形成相应的MC异构体，如在LR型中，X和Y分别代表亮氨酸和精氨酸，此外，还有RR、YR等其他多种类
45、型藻毒素。迄今，从野外或实验室培养微囊藻中已分离出近70种毒素异构体6。在已知的MC的异构体中，以MCLR的生理毒性最强是目前已知毒性仅次于二噁英的剧毒化合物。MC结构中所含共轭二烯型氨基酸，3氨基9甲氧基2,6,8三甲基10苯基4,6二烯酸ADDAADDA3氨基9甲氧基2,6,8三甲基10苯基4,6二烯酸是表达该类毒素生理活性的最主要特征结构，分别通过形成1,2两个肽键与其他氨基酸缩合成环。除MC外，还有一类名为节球藻毒素NODULARIN的环状五肽也具有ADDA结构。MC和NODULARIN两类肝毒素主要通过生物体的胆汁酸传输系统在生物体内运输并在肝脏、肾脏及消化道组织中累积，然后通过共价
46、键与蛋白磷酸酶结合。这种结合将直接抑制蛋白磷酸酶1和2A的活性，阻断蛋白磷酸化过程，最终导致肝脏等器官的纤维化，促发肿瘤形成。研究表明，当MC特征结构ADDA结合不等数量的氨基酸形成不同长度的肽键后，就会对蛋白磷酸酶1和2A表现出不同程度的抑制作用，即不同的毒性效应7，引发乳动物肝细胞微丝分裂、破裂和出血，肝充血肿大，失血休克死亡等病症8。即使ADDA只和一个氨基酸结合形成肽键后，也会对蛋白磷酸酶起到一定的抑制作用。但未形成肽键的ADDA经生物检测，未表现出明显毒性效应。因此，ADDA结构对这两类肝毒素的毒性行为起到至关重要的作用。MC也能导致细胞的代谢紊乱，释放出大量炎性物质和细胞因子，引起
47、机体的损伤9。微囊藻毒素的分析方法主要有生物分析方法，化学分析方法和生物化学分析方法。生物分析方法主要是（1）采用MC毒素合成酶基因MCY基因，鉴定筛选产藻毒素藻株，该法检测下限低，灵敏度高，方便快捷，可检测干藻粉、实验室培养物、无前处理的自然水样等，但不能定量和无法检测溶解的MC10；（2）采用对小鼠进行灌喂或腹腔注射来鉴定藻毒素的毒性，根据其急性毒性初步筛选，粗略地判断提取物是否有毒性，然后根据毒素作用特点区分神经毒性或肝毒性，并粗略判断毒素含量，但不能鉴定藻毒素结构，该方法操作简便，可快速直观获取结果，但样品需要量大，无法精确定量。化学分析法对藻毒素可进行精确的定性、定量检测，包括高效液
48、相色谱法HPLC11、二极管阵列检测器DAD12电化学检测器联用、色谱/质谱联用法LC/MS、质谱HPLCMS、毛细管电泳CEMS、高效毛细管电泳HPCE13、气相色谱和质谱GCPMS联用及薄层色谱法TLC等。在化学检测方法中使用较多的是HPLC，HPLC一般用恒溶剂作为流动相，分离柱为ODS反相柱，可以分离包括MCLR、RR、YR和其他藻毒素14，利用梯度洗脱可以分离更多的MC，然后进行紫外UV、荧光FL、化学发光CL或二极管阵列紫外检测器检测，可广泛用于MC的鉴定和定量检测。将被测毒素与标准毒素的滞留时间进行比较可对被测毒素进行鉴定，将两者的峰面积进行比较可对其进行精确定量。HPLC方法技
49、术含量高，价格昂贵；还必须备有标准纯毒素或者某毒素在相同实验条件下的保留值。张昱等15通过固相萃取SPE富集微囊藻毒素MC，并采用液相色谱电喷雾电离质谱，HPLC/ESIMS测定水源水中的MCRR、YR和LR。固相萃取回收率在85以上，固相萃取HPLCMS法的线性检测限为05500NG/L16。STUARTAOEHRLE等用改进的超高效液相色谱（UPLC）串联质谱测定方法，在八分钟内迅速而清晰的分析出了有特异性和高峰值的每一种实验藻毒素。生物化学分析方法主要包括酶联分析法ELISA17、蛋白磷酸酶抑制分析法PPIA18、免疫检测法等，此类方法因其快速、灵敏及工作原理简单易行得以迅速发展，适合分析处理大批样品，但不能对毒素起到良好的鉴别作用，会出现假阳性反应。目前由于微囊藻毒素单克隆抗体难以获得而又受到一定的限制19。高效液相色谱具有高分离效能，高灵敏度，进样量在UL数量级，应用范围广，分析速度较快，易回收等优势。在质谱应用领域里，三重四级杆是最灵敏和定量重现性最好的仪器，同时在丢失扫描和母子离子扫描模式有最好的准确性和灵敏性。本课题使用高效液相色谱三重四级杆质谱分析系统（HPLCQQQQQQMS）对藻毒素研究分析，该方法灵敏、准确，方法检测限达到001NG/ML，能够满足国内外的限量要求，相对于紫外，荧光等等方法更能精确定量分析。参
