1、本科毕业设计（20_届）利用固相萃取液质联用技术快速筛选产毒藻种及毒素种类所在学院专业班级生物工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月1目录1引言12实验221仪器和试剂222淡水藻培养和毒素预处理323标准样品的配制324色谱和质谱条件33结果与讨论431质谱离子化条件的选择和色谱分离432定量标准曲线和方法检测限833方法的回收率和精密度834实际藻类和水样测定114结论11致谢12参考文献13附录错误未定义书签。2摘要【摘要】对购买来的12种标准藻毒素甲醇进行定溶，然后再进行稀释，得到各个浓度的混合溶液。利用高效液相色谱三重四级杆质谱（HPLCQQQMS）对混合溶液进行分析；采用电喷雾电
2、离源正离子模式，分别取其母离子和子离子作为目标离子进行检测。结果表明，12种藻毒素在HYPERSILGOLDC18色谱柱上得到良好分离，方法在050NG/ML浓度范围内线性相关系数高于09900，方法的最低检测限001NG/ML，得到满意的回收率在910和1058之间，相对标准偏差小于71；三种甲壳动物肌肉中蜕皮激素回收率达857912，相对标准偏差小于87。对实际培养的藻体和采集的水样进行分析，检测其藻毒素及浓度。【关键字】微囊藻毒素；回收率；高效液相色谱三重四级杆质谱（HPLCQQQMS）【ABSTRACT】AFACILEMETHODBASEDONREVERSEDPHASELIQUIDCH
3、ROMATOGRAPHYCOUPLEDWITHTRIPLEQUADRUPOLEMASSSPECTROMETRYHPLCQQQMSHASBEENESTABLISHEDFORTHEANALYSISOFTOXINMETHANOL,ACETONITRILEAND01FORMICACIDWEREUSEDASTHESOLVENTGRADIENTANDHYPERSILGOLDC18REVERSEDPHASECOLUMNWASUSEDFORSEPARATIONANDTHEMASSSPECTROMETERWASOPERATEDINPOSITIVEIONMODEUSINGSE1ECTREACTIONMONITOR
4、INGSRMFORQUANTITATIVEANALYSESTHERESULTSSHOWEDTHATTWELVETOXINSWERESEPARATEDEFFICIENTLYINTHEC18COLUMNTHELINEARITYWASSUPERIORATTHERANGEOF050NG/ML,WITHCORRELATIONCOEFFICIENTABOVE09900THELOWDETECTIONLIMITWASBELOW020NG/MLANDTHELOWQUANTITATIVELIMITWASLOWERTHAN060NG/MLTHERECOVERYOFTOXINSEXCEPTNODULARIN,ANAT
5、OXINANDCYLINDROSPERMOSPINWEREFROM597814016,WITHRSDLESSTHAN861USINGTHISMETHOD,THETYPEANDCONCENTRATIONOFTOXINS,EXTRACTEDFROMALGAEANDWATERSAMPLES,WEREDETERMINEDBYHPLCQQQ/MSANALYSISTOTHE12ONTHEPURCHASEOFTHESTANDARDSETOFMICROCYSTINMETHANOLSOLUTION,ANDTHENFURTHERDILUTEDTOOBTAINAMIXEDSOLUTIONOFVARIOUSCONCE
6、NTRATIONSHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYTRIPLEQUADRUPOLEMASSSPECTROMETRYHPLCQQQMSANALYSISOFTHEMIXEDSOLUTIONBYELECTROSPRAYIONIZATIONPOSITIVEIONMODE,WERETAKENASTHEPARENTIONANDDAUGHTERIONSTARGETIONSWEREDETECTEDTHERESULTSSHOWEDTHAT12SPECIESOFALGAETOXINSINTHEHYPERSILGOLDC18COLUMNGETGOODSEPARATION,THE
7、METHODINTHE050NG/MLCONCENTRATIONRANGEOFLINEARCORRELATIONCOEFFICIENTSHIGHERTHAN09900,THELOWESTMETHODDETECTIONLIMIT001NG/ML,THERECOVERYOFSATISFACTORYRATEOF910AND1058,ANDTHERELATIVESTANDARDDEVIATIONLESSTHAN71THREECRUSTACEANMOLTINGHORMONEINMUSCLERECOVERYRATEOF857912,RELATIVESTANDARDDEVIATIONLESSTHAN87TH
8、EACTUALCULTUREOFALGAEANDWATERSAMPLESFORANALYSIS,DETECTIONANDCONCENTRATIONOFTHEALGAETOXIN【KEYWORDS】TOXINSHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYTRIPLEQUADRUPOLEMASSSPECTROMETRYHPLCQQQ/MSQUANTITATIVEANALYSISMICROCYSTINRECOVERYHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYTRIPLEQUADRUPOLEMASSSPECTROMETRYHPLCQQQMS31引言
9、近年来，一些作为饮用水源的湖泊、水库等水体富营养化及蓝藻水华爆发已严重威胁到人民群众的饮用水安全1。蓝藻水华爆发不仅造成水质下降，而且还释放出内源性藻毒素，其中微囊藻毒素MC是出现频率最高，危害最严重的藻类毒素2，微囊藻毒素LRMCLR是我国富营养化水体中毒性较大的常见亚型，能强烈抑制蛋白磷酸酶1PP1和蛋白磷酸酶2APP2A的活性3，具有肝脏毒性和肿瘤促进作用4。除了微囊藻（MICROCYSTIS外，蓝藻门中的鱼腥藻属ANABAENA、浮丝藻属PLANKTOTHRIX、束丝藻属APHANIZOMENON中的某些种类也能产生此类毒素。1996年在巴西造成100多名急性肝功能故障，7个月内至少5
10、0人死于藻毒素产生的急性效应，引起举世瞩目的关注。淡水水体中的蓝藻毒素已成为全球性的环境问题，世界各地经常发生蓝藻毒素中毒事件。MC是一类环状七肽化合物（如图1），其中，环肽结构中含有X和Y两个可变的氨基酸基团5。X和Y的不同氨基酸组合可以形成相应的MC异构体，如在LR型中，X和Y分别代表亮氨酸和精氨酸，此外，还有RR、YR等其他多种类型藻毒素。迄今，从野外或实验室培养微囊藻中已分离出近70种毒素异构体6。在已知的MC的异构体中，以MCLR的生理毒性最强是目前已知毒性仅次于二噁英的剧毒化合物。MC结构中所含共轭二烯型氨基酸，3氨基9甲氧基2,6,8三甲基10苯基4,6二烯酸ADDAADDA3氨
11、基9甲氧基2,6,8三甲基10苯基4,6二烯酸是表达该类毒素生理活性的最主要特征结构，分别通过形成1,2两个肽键与其他氨基酸缩合成环。除MC外，还有一类名为节球藻毒素NODULARIN的环状五肽也具有ADDA结构。MC和NODULARIN两类肝毒素主要通过生物体的胆汁酸传输系统在生物体内运输并在肝脏、肾脏及消化道组织中累积，然后通过共价键与蛋白磷酸酶结合。这种结合将直接抑制蛋白磷酸酶1和2A的活性，阻断蛋白磷酸化过程，最终导致肝脏等器官的纤维化，促发肿瘤形成。研究表明，当MC特征结构ADDA结合不等数量的氨基酸形成不同长度的肽键后，就会对蛋白磷酸酶1和2A表现出不同程度的抑制作用，即不同的毒性
12、效应7，引发乳动物肝细胞微丝分裂、破裂和出血，肝充血肿大，失血休克死亡等病症8。即使ADDA只和一个氨基酸结合形成肽键后，也会对蛋白磷酸酶起到一定的抑制作用。但未形成肽键的ADDA经生物检测，未表现出明显毒性效应。因此，ADDA结构对这两类肝毒素的毒性行为起到至关重要的作用。MC也能导致细胞的代谢紊乱，释放出大量炎性物质和细胞因子，引起机体的损伤9。微囊藻毒素的分析方法主要有生物分析方法，化学分析方法和生物化学分析方法。生物分析方法主要是（1）采用MC毒素合成酶基因MCY基因，鉴定筛选产藻毒素藻株，该法检测下限低，灵敏度高，方便快捷，可检测干藻粉、实验室培养物、无前处理的自然水样等，但不能定量
13、和无法检测溶解的MC10；（2）采用对小鼠进行灌喂或腹腔注射来鉴定藻毒素的毒性，根据其急性毒性初步筛选，粗略地判断提取4物是否有毒性，然后根据毒素作用特点区分神经毒性或肝毒性，并粗略判断毒素含量，但不能鉴定藻毒素结构，该方法操作简便，可快速直观获取结果，但样品需要量大，无法精确定量。化学分析法对藻毒素可进行精确的定性、定量检测，包括高效液相色谱法HPLC11、二极管阵列检测器DAD12电化学检测器联用、色谱/质谱联用法LC/MS、质谱HPLCMS、毛细管电泳CEMS、高效毛细管电泳HPCE13、气相色谱和质谱GCPMS联用及薄层色谱法TLC等。在化学检测方法中使用较多的是HPLC，HPLC一般
14、用恒溶剂作为流动相，分离柱为ODS反相柱，可以分离包括MCLR、RR、YR和其他藻毒素14，利用梯度洗脱可以分离更多的MC，然后进行紫外UV、荧光FL、化学发光CL或二极管阵列紫外检测器检测，可广泛用于MC的鉴定和定量检测。将被测毒素与标准毒素的滞留时间进行比较可对被测毒素进行鉴定，将两者的峰面积进行比较可对其进行精确定量。HPLC方法技术含量高，价格昂贵；还必须备有标准纯毒素或者某毒素在相同实验条件下的保留值。张昱等15通过固相萃取SPE富集微囊藻毒素MC，并采用液相色谱电喷雾电离质谱，HPLC/ESIMS测定水源水中的MCRR、YR和LR。固相萃取回收率在85以上，固相萃取HPLCMS法的
15、线性检测限为05500NG/L16。STUARTAOEHRLE等用改进的超高效液相色谱（UPLC）串联质谱测定方法，在八分钟内迅速而清晰的分析出了有特异性和高峰值的每一种实验藻毒素。生物化学分析方法主要包括酶联分析法ELISA17、蛋白磷酸酶抑制分析法PPIA18、免疫检测法等，此类方法因其快速、灵敏及工作原理简单易行得以迅速发展，适合分析处理大批样品，但不能对毒素起到良好的鉴别作用，会出现假阳性反应。目前由于微囊藻毒素单克隆抗体难以获得而又受到一定的限制19。高效液相色谱具有高分离效能，高灵敏度，进样量在UL数量级，应用范围广，分析速度较快，易回收等优势。在质谱应用领域里，三重四级杆是最灵敏
16、和定量重现性最好的仪器，同时在丢失扫描和母子离子扫描模式有最好的准确性和灵敏性。本课题使用高效液相色谱三重四级杆质谱分析系统（HPLCQQQQQQMS）对藻毒素研究分析，该方法灵敏、准确，方法检测限达到001NG/ML，能够满足国内外的限量要求，相对于紫外，荧光等等方法更能精确定量分析。参考文献1VANAPELDOORNME,VANEGMONDHP,SPEIJERSGJA,ETALTOXINSOFCYANOBACTERIAJMOLECULARNUTRITIONANDFOODRESEARCH,2007,5117602PALUSJ,DZIUBALTOWSKAE,STANCZYKM,ETALBIOM
17、ONITORINGOFCYANOBACTERIALBLOOMSINPOLISHWATERRESERVOIRANDTHECYTOTOXICITYANDGENOTOXICITYOFSELECTEDCYANOBACTERIALEXTRACTSJINTERNATIONALJOURNALOFOCCUPATIONALMEDICINEANDENVIRONMENTALHEALTH,2007,20148653MACKINTOSHC,BEATTIEKA,KLUMPPS,ETALCYANOBACTERIALMICROCYSTINLRISAPOTENTANDSPECIFICINHIBITOROFPROTEINPHOS
18、PHATASE1AND2AFROMBOTHMAMMALSANDHIGHERPLANTSJFEBSLETTERS,1990,26421871924FALCONERIRTUMORPROMOTIONANDLIVERINJURYCAUSEDBYORALCONSUMPTIONOFCYANOBACTERIAJENVIRONMENTALTOXICOLOGYANDWATERQUALITY,1991,621771845MONICABARCO,CINTIAFLORES,JOSEPRIVERA,JOSEPCAIXACHDETERMINATIONOFMICROCYSTINVARIANTSANDRELATEDPEPTI
19、DESPRESENTINAWATERBLOOMOFPLANKTOTHRIXOSCILLATORIARUBESCENSINASPANISHDRINKINGWATERRESERVOIRBYLC/ESIMSTOXICON4420048818866DIEHNELTCW,DUGANNR,PETERMANSMETALIDENTIFICATIONOFMICROCYSTINTOXINSFROMASTRAINOFMICROCYSTISAERUGINOSABYLIQUIDCHROMATOGRAPHYINTRODUCTIONINTOAHYBRIDLINEARIONTRAPFOURIERTRANSFORMIONCYC
20、LOTRONRESONANCEMASSSPECTROMETERANALLCHEM,2006,785015127HOLMESCFB,BOLANDMPINHIBITORSOFPROTEINPHOSPHATASE1AND2ATWOOFTHEMAJORSERINE/THREONINEPROTEINPHOSPHATASESINVOLVEDINCELLULARREGULATIONCURROPININSTRUCBIOL,1993,39349438肖兴富,李文奇,刘娜，等富营养化水体中蓝藻毒素的危害及其控制J中国水利水电科学研究院学报,2005,321161239黄湫淇,詹平微囊藻毒素的细胞毒性及机制研究状况
21、J预防医学情报杂志,2005,21330430610程斌,浦跃朴,尹立红藻毒素的检测与生物学效应评价的研究进展J东南大学学报医学版,2004,231576111LAWTONLA,EDWARDSC,CODDGAEXTRACTIONANDHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHICMETHODFORTHEDETERMINATIONOFMICROCYSTINSINRAWANDTREATEDWATERSJANALYST,1994,119715251530512郑力行,吴和岩,施玮高效液相色谱法测定水中微囊藻毒素的含量J中国卫生检验杂志,2004,14552652713AGU
22、ETEECA,GAGOMARTNEZA,LEAO,JM,ETALHPLCANDHPCEANALYSISOFMICROCYSTINSRR,LRANDYRPRESENTINCYANOBACTERIAANDWATERBYUSINGIMMUNOAFFINITYEXTRACTIONJTALANTA,2003,59469770514JMERILUTOTCHROMATOGRAPHYOFMICROCYSTINSJANALCHIMACTA,1997,35227729815张昱,杨敏,李宗来,等液相色谱电离质谱法测定微囊藻毒素J中国给水排水,2005,214949616LIMINGCONG,BAIFENHUANG
23、,QICHEN,BAIYILU,JINGZHANG,YIPINGRENDETERMINATIONOFTRACEAMOUNTOFMICROCYSTINSINWATERSAMPLESUSINGLIQUIDCHROMATOGRAPHYCOUPLEDWITHTRIPLEQUADRUPOLEMASSSPECTROMETRYJANALYTICACHIMICAACTA569200615716817STUARTAOEHRLE,BENSOUTHWELL,JUDYWESTRICKDETECTIONOFVARIOUSFRESHWATERCYANOBACTERIALTOXINSUSINGULTRAPERFORMANC
24、ELIQUIDCHROMATOGRAPHYTANDEMMASSSPECTROMETRYJTOXICON,2010,555,96597218ANJ,CARMICHAELWWUSEOFACOLORIMETRICPROTEINPHOSPHATASEINHIBITIONASSAYANDENZYMELINKEDIMMUNOSORBENTASSAYFORTHESTUDYOFMICROCYSTINSANDNODULARINSJTOXICON,1994,32121495150719TUBAROA,FLORIOC,LUXICHE,ETALSUITABILITYOFTHEMTTBASEDCYTOTOXICITYA
25、SSAYTODETECTOKADAICACIDCONTAMINATIONOFMUSSELSJTOXICON,1996,3497432实验21材料和方法11仪器和试剂TSQQUANTUMACCESS液相色谱一三重四极杆质谱联用分析系统（美国THERMOFISHERSCIENTIFIC公司），超纯水系统（法国MILLIPORE公司）。甲酸（色谱纯，美国SIGMAALDRICH公司），甲醇、乙腈（色谱纯，美国TEDIA公司），纯水由超纯水系统制备。SEPPAKC18固相萃取小柱3CC，60MG美国WATERS公司，SEPPAKSILICA固相萃取小柱3CC，60MG美国WATERS公司。12种标准藻
26、毒素（如表1）其他试剂均为国产分析纯。表112种标准藻毒素简介藻毒素名称分子式粉末干重UG供应商ANATOXINC10H15NO25美国ALEXIS公司CYLINDROSPERMOSPINC15H21N5O7S25美国ALEXIS公司DINOPHYSISTOXIN1DTX1C45H70O13100日本和光纯药工业株式会社NODULARINC41H60N8O1050ALGALSCIENCE公司OKADAICACID（OA）C44H68O1325美国ALEXIS公司MICORCYSTINYRC52H72N10O1325美国ALEXIS公司MICORCYSTINLRC49H74N10O1250ALG
27、ALSCIENCE公司MICORCYSTINLAC46H67N7O1225美国ALEXIS公司MICORCYSTINLYC52H71N7O1325美国ALEXIS公司MICORCYSTINLWC54H72N8O1225美国ALEXIS公司MICORCYSTINRRC49H75N13O1250ALGALSCIENCE公司MICORCYSTINLFC52H71N7O1225美国ALEXIS公司122淡水藻培养和毒素预处理本试验所用的3株MICROCYSTISAERUGINOSA（MA1、MA2、MA3），21株MICROCYSTISFLOSAQUAE（MF2、MF3），21株MICROCYSTIS
28、WESENBERGII（MW1、MW2），1株MICROCYSTISELABENSME1，1株MICROCYSTISVIRIDIS（MV1），1株MICROCYSTISICHY0BLABEMI1），均购置于中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库FACHBCOLLECTION。藻种采用BG11液体培养基培养，培养温度25，光照强度1827MOLM2S1，光暗循环为L1212，每天摇瓶12次，静置培养。6对毒素的预处理取1L处于指数生长期的微囊藻离心富集，加入30ML15乙酸。65水浴10MIN，超声破碎10MIN，重复水鱼、超声2次。用045M滤膜抽滤，滤液经C18小柱过滤。C18小柱的处理过
29、程1C18小柱（500MG|/6ML）预活化10ML纯甲醇10ML去离子水2大约30ML滤液过柱3杂质淋洗20ML20甲醇4毒素洗脱10ML90酸化甲醇，洗脱液收集于15ML离心管中5旋转蒸发及定容洗脱液用15ML棕色进样瓶收集旋转蒸发至1ML（05ML左右），20下保存待测。收集的滤液，采用液相色谱三重四极杆质谱仪（LCMS）的SRM扫描模式进行微囊藻毒素分析。123标准样品的配制将12种藻毒素的粉末分别溶于1ML的甲醇置（4冰箱中保存）。取部分标准样品溶液再用甲醇进行混溶，得到其中的每个样品的浓度都是2PPM的1L甲醇溶液。然后取部分对其再进行稀释，分别得到各样品浓度为500PPB，200
30、PPB，20PPB，2PPB，1PPB的1L甲醇溶液（其中MCLR和MCRR另增浓度为50G/MLPPM的标准溶液）。124色谱和质谱条件HYPERSILGOLDC18色谱柱（100MM21MM17M）（美国THERMOFISHERSCIENTIFIC公司），进样量10L，柱温30，流动相为01甲酸水溶液（A）、甲醇（B）和乙腈（C），流速02ML/MIN，洗脱梯度为TIMEMINMETHANOL01FORMICACIDACN04906612701814166024242245333032204831400603240060334906404906采用电喷雾电离源正离子电离模式，雾化气采用氮气
31、，喷雾电压28KV，鞘气流量30L/MIN，辅助气流量10L/MIN，离子传输毛细管温度300，扫描采用选择反应监测（SRM）模式。采集时间均为02S，碰撞气采用氩气，碰撞气压力15MTORR。Q1和Q3分辨率均设定为半峰宽07DA。315方法本试验通过高效液相色谱串联三重四级杆质谱法（HPLCQQQMS）来测定水样中的藻毒素浓度。首先利用购买来的12种标准藻毒素来测出该藻毒素的浓度/峰面积比标准曲线，并且通过测出其最低检测限、定量限、加标回收率、保留时间和峰面积的相对标准偏差等来验证该方法的可行性和优势。最后通过该方法来对实际藻样和采集而来的实际水样进行藻毒素测试，测出其浓度。2实验231质
32、谱离子化条件的选择和色谱分离用1G/ML标准藻毒素的标准溶液，以流动注射方式进行ESI源质谱分析。在正离子模式下进行检测，12种藻毒素分子在正离子模式主要产生三种正离子，分别为MH、MNA和M2H2如表2，如藻毒素ANATOXIN主要出现MH离子，藻毒素RR主要出现M2H2离子，藻毒素CYLINDROSPERMOSPIN主要出现MNA离子。在正离子模式下，20种藻毒素的分别对应的准分子离子峰信号最强，与文献报道一致，故选择各目标化合物的正离子作为选择检测模式下的母离子（如图12）。对其进行二级质谱扫描，12种标准藻毒素分子主要产生碎片离子也见表2，例如藻毒素LR的二级质谱扫描图（见图23），母
33、离子经过能量碰撞以后产生的主要碎片为M/Z10344和1348。选取信号最强的子离子，作为定量离子；选取丰度次强的子离子作为各自的辅助定性离子，最后以选择反应监测（SRM）正离子模式优化锥孔电压（TUBELENSOFFSET）、碰撞能量（COLLISIONENERGY）等质谱参数的优化。表212种藻毒素的质谱保留时间，分子量，准分子离子峰及子离子（碰撞能量）7ANALYTETR（MIN）MOLECULARWEIGHTMNAIONMHIONM2H2IONDAUGHTERION（COLLISIONENERGY（V）ANATOXIN1571651/1660/911（15）,1311（20）,1491
34、11CYLINDROSPERMOSPIN15641544379/176037,295927,317922DINOPHYSISTOXIN1316881848412/585053,737246,823242NODULARIN14288244/8252/135156,209156,226749OKADAICACID291480448272/571052,723245,809335MICORCYSTINYR158910441/10455/135070,213360MICORCYSTINLR17109945/9955/103475,134866MICORCYSTINLA26179094/9105/212
35、946,402125,776418MICORCYSTINLY268310021/10025/135060,213046,264949MICORCYSTINLW298210251/10255/213050,500326,517127MICORCYSTINRR119710375/5197103046,105335,135130MICORCYSTINLF31069855/9865/135045,249042,4780258图1212种标准藻毒素在4PPB浓度下的各个质谱扫描图表212种藻毒素的保留时间，分子量，准分子离子峰及子离子（碰撞能量）ANALYTETR（MIN）MOLECULARWEIGHT
36、MNAIONMHIONM2H2IONDAUGHTERION（COLLISIONENERGY/V）ANATOXIN1671651/1660/911（15）,1311（20）,149111CYLINDROSPERMOSPIN14841544379/176037,295927,317922DINOPHYSISTOXIN1324181848412/585053,737246,823242NODULARIN15998244/8252/135156,209156,226749OKADAICACID296880448272/571052,723245,809335MICORCYSTINYR176110441
37、/10455/135070,213360MICORCYSTINLR18599945/9955/103475,134866D研究藻毒素110225ST4PPB120110227144021RT00040010510152025303540TIMEMIN050100050100050100050100RELATIVEABUNDANCE050100050100157191370628156183589852119713069491823215914281521209998629142860338725733168348130882341NL716E4TICFCESISRMMS216600091189
38、91191,105109105111,131109131111,149109149111MSST4PPB1NL913E3TICFCESISRMMS2437946176059176061,295921295923,317956317958MSST4PPB1NL336E4TICFCESISRMMS2519710103191103193,105306105308,135140135142MSST4PPB1NL169E4TICFCESISRMMS2825250135129135131,209103209105,226754226756MSST4PPB1NL857E3TICFCESISRMMS28272
39、25571070571072,723285723287,809323809325MSST4PPB1NL918E3TICFCESISRMMS2841224585022585024,737220737222,823288823290MSST4PPB1RT00040010510152025303540TIMEMIN050100050100050100050100RELATIVEABUNDANCE05010005010026172671248638392927226931063170343529182538171017492177104814632683275425243437231029823037
40、39852676238215891623117720102183NL760E3TICFCESISRMMS2910500212959212961,402183402185,776399776401MSST4PPB1NL633E3TICFCESISRMMS2986500134999135001,249099249101,478099478101MSST4PPB1NL147E3TICFCESISRMMS2995442103444103446,134806134808MSST4PPB1NL537E3TICFCESISRMMS21002500134999135001,212999213001,26489
41、9264901MSST4PPB1NL685E3TICFCESISRMMS21025500212999213001,500299500301,517099517101MSST4PPB1NL131E3TICFCESISRMMS21045500134999135001,213299213301MSST4PPB19MICORCYSTINLA25979094/9105/212946,402125,776418MICORCYSTINLY268610021/10025/135060,213046,264949MICORCYSTINLW296210251/10255/213050,500326,517127M
42、ICORCYSTINRR139810375/5197103046,105335,135130MICORCYSTINLF30589855/9865/135045,249042,478025图23藻毒素LR的二级质谱图对于12种标准藻毒素的分析，一般采用01甲酸水、甲醇和乙腈作为流动相，在C18反相柱上进行色谱分离。本实验分别采用甲醇、乙腈以及11甲醇/乙腈VV作为有机相，发现当使用乙腈作为有机相时，信号响应最强。结合质谱离子化条件的选择，在流动相的水相中加入甲酸，可以优化峰形，提高离子化效率。流动相甲酸酸浓度对藻毒素色谱峰的峰形会产生较大的影响。经反复实验，采用01甲酸获得理想的峰形。232定量
43、方法曲线和方法检测限分别配制含每种藻毒素2UG/MLPPM，5000500UG/MLPPB，0200UG/MLPPB，0020UG/MLPPB，00042UG/MLPPB，D研究藻毒素110225ST500PPB32011022821823RT00040020246810121416182022242628303234363840TIMEMIN0102030405060708090100RELATIVEABUNDANCE1665173616031865212912109601403NL128E5TICFCESISRMMS2995442103444103446,134806134808MSST5
44、00PPB3ST500PPB33198RT1669AV1NL648E4FCESISRMMS2995442103444103446,134806134808103444510344501034455M/Z13480601348065134807013480751348080M/Z0102030405060708090100RELATIVEABUNDANCERELATIVEABUNDANCE1034413481100001UG/MLPPB12种藻毒素的标准混合样（MCRR和LC增加浓度为5PPM的混合标准溶液），在上述条件下（第14节）进行LCMS分析。在02G/ML（MCRR和LR为050G/M
45、L）浓度范围内的线性方程如表3所示，相关系数R2大于09900，线性良好。由于水样中藻毒素含量大多很低，均在相应的线性范围内，故采用此标准曲线对实际采集的水样中的藻毒素进行定量分析。表312种藻毒素的标准曲线，检测范围，最低检测限及定量限，加标回收率（100PPB）ANALYTECALIBRATIONCURVER2TESTRANGEG/MLMLLODNG/MLLOQNG/MLRECOVERY（RSD,）ANATOXINY83917512604X09983000120150501678CYLINDROSPERMOSPINY106957451918X0999500012004020016DINOP
46、HYSISTOXIN1DTX1Y216774708061X099980001201505014013NODULARINY502788744426X09984000120040203947OKADAICACIDY470619817181X099580001202005010867MICORCYSTINYRY15849978657X09958000120150505978MICORCYSTINLRY103138743658X099600001500100407179MICORCYSTINLAY61557820563X09980000120200509840MICORCYSTINLYY5154171
47、68638X099970001200401210108MICORCYSTINLWY461177497671X099900001201504010480MICORCYSTINRRY103413836569X099870001500010046612MICORCYSTINLFY487855595621X099900001201506010340进样10L浓度为1G/ML的标准样品混合溶液，在质谱上测得藻毒素定量特征碎片离子的信噪比（S/N）为189，将对应信噪比为3的标准样品量作为最低检测限，可计算出该方法对藻毒素的检测限（如表3所列），相比薄层扫描法检测限314G/MLML、放射免疫法检测限23
48、NG/ML、其他高效液相色谱串联质谱法检测限在0110NG/ML之间，可见，本文建立的用三重四级杆质谱检测藻毒素方法灵敏度很高。233方法的回收率和精密度对于所开发的方法的准确性，首先用回收率试验来验证。一个不含有藻毒素的新鲜水样用来作为空白样品，然后把定量藻毒素加入到空白样品中，得到指定浓度的标准样品溶液。然后，空白样品和加有藻毒素的样品都进行样品预处理步骤，并且进行在第14节当中条件的HPLCMS/MS分析。如表列出，开发的测试藻毒素的方法得到满意的回收率在910和1058之间。其中藻毒素ANATOXIN和CYLINDROSPERMOSPIN得到的结果不是很理想，该两种藻毒素不适合用本试验
49、方法进行分析，将会进一步研究。用12个标准样品来评估该方法的精密度，用在第14节所述条件下的HPLCMS/MS分析。为了评估其日内精密度，准备了5种平行的测试溶液在一天内全部分析，同时检验这53表412种藻毒素的保留时间和峰面积精密度数据个测量值的相对标准偏差（RSD）。对于其日间精密度评估，准备3种平行的测试溶液在连续5天内每天11进行分析，同时检验在这个7天内得到的测量值的RSD。12种微囊藻毒素的日内和日间精密度的观测结果列于表4。由此可见，本试验开发的方法灵敏、准确、精密度高，方法检测限达到001NG/ML，能够满足国内外的限量要求，相对于紫外，荧光等等方法更能精确定量分析。34实际藻类和水样测定对购买来的经过培养藻类和实际采集的水样1L经过样品前处理，得到干藻毒素，溶于05ML甲醇，定溶，进行在上述条件下（14）的LCMS分析，根据其中的特征碎片离子来检测是否含有上述的12种标准藻毒素，并通过其峰面积和该藻毒素的标准曲线求出浓度，具体如表5所示。表5已测样品及其数据（MICROCYSTISAERUGINOSA（MA1、MA2、MA3），MICROCYSTISFLOSAQUAE（MF3），MICROCYSTISWESENBERGII（MW1），MICROCYSTIS
