1、本科毕业设计（20_届）三种致病弧菌对大黄鱼血液生理生化的影响所在学院专业班级水产养殖学学生姓名学号指导教师职称完成日期年月2目录引言21材料与方法311实验材料3111实验用鱼3112实验菌株3113试剂3114仪器312实验方法3121各菌株人工感染浓度的确定3122实验分组3123菌悬液的配制3124人工感染3125样品采集3126红细胞和白细胞计数4127白细胞分类计数4128NBT阳性细胞计数4129吞噬细胞吞噬能力测定41210血液生化指标的测定41211数据处理及分析42结果与分析421弧菌感染对大黄鱼红细胞数量的影响422弧菌感染对大黄鱼白细胞数量的影响523弧菌感染对大黄鱼白
2、细胞分类计数的影响624弧菌感染对大黄鱼NBT阳性细胞的影响725弧菌感染对大黄鱼吞噬细胞吞噬活力的影响726弧菌感染对血清中糖类、脂类及蛋白质代谢产物含量的影响927弧菌感染对血清中蛋白质类物质含量的影响1028弧菌感染对血清中酶类物质活性的影响1129弧菌感染对血清中电解质含量的影响123讨论1331弧菌感染对大黄鱼血液红细胞的影响1432弧菌感染对大黄鱼血液白细胞的影响1433弧菌感染对大黄鱼免疫细胞的影响1534弧菌感染对大黄鱼血液生化指标的影响15致谢错误未定义书签。参考文献161摘要本研究将健康大黄鱼分为3个实验组和1个对照组，分别注射02ML的哈氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和灭菌
3、生理盐水，在感染后的0，1，2，4，7，10，13，16，20D分别采样。测定血液中各项生理生化指标，来探讨三种致病弧菌对大黄鱼非特异性免疫机能的影响。结果显示大黄鱼血液生理指标的变化主要发生在感染后的17D。感染初期，各实验组大黄鱼红细胞数量有所下降，白细胞显著上升P005，实验组与对照组差异极显著P005。4D后，实验组红细胞数量升高与对照组差异不显著P005，实验组红细胞数量上升与对照组差异极显著P005；实验组与实验组、之间存在极显著差异P005；同组不同字母表示差异显著P005；实验组与实验组之间存在极显著差异P005；但实验组间存在差异，10D时实验组与实验组、之间差异显著P005
4、。感染4D后，实验组淋巴细胞百分比均有所上升，实验组和上升幅度不大与对照组差异不显著P005，实验组与对照组差异显著P005；同一列不同字母表示差异显著P005。10D时，实验组、与对照组无明显差异，但是实验组与实验组之间存在显著差异P005；实验组和之间却存在显著性差异P005，实验组略有下降与对照组差异不显著P005；实验组与、之间存在极显著差异P005；然而实验组和实验组、实验组、对照组之间都存在显著差异P005，实验组和达到峰值与对照组差异极显著P005，但是实验组和之间PP值存在显著差异P005；而实验组与之间差异极显著P005，实验组急10剧下降与对照组差异极显著P005，实验组与
5、对照组相比也显著升高P005，实验组持续上升与对照组差异显著P005，但实验组与实验组之间存在显著差异P005，但与实验组、之间差异极显著P005，但实验组、与实验组之间却存在显著差异P005；感染后第710D内各实验组总胆固醇含量明显升高，其中实验组和显著高于对照组P005，第10D时实验组、与实验组之间存在显著差异P005，实验组与实验组、之间存在显著差异P005；各实验组白蛋白ALB含量也明显升高，实验组、上升较大与对照组差异显著P005，因此实验组与实验组、之间存在极显著差异P005，实验组上升较快与对照组差异显著13P005，实验组与实验组、之间存在显著差异P005。感染4D时，各实
6、验组K的含表6大黄鱼溃疡病血清中电解质含量比较TABLE6THECOMPARISONOFSERUMELECTROLYTECONTENTONULCERDISEASEOFPSEUDOSCIAENACROCEA时间实验组别钾钠氯镁磷铁钙TIMEGROUPKNACLMGPFECA0D530077A16110721A14400566A181011A343006A1700297A288008A557038A16850325A14900000A181001A350008A1500549A301014A503023A16880679A14700566A180013A341013A1500212A276035A
7、555000A16180115A15200000A200001A357000A1600000A317000A1D352064AB16560453A14350495A123011A387004A900000A264008A324047AB16045304A13950212A122011A365016A1850354B265018A471188A16125219A14250212A111017A355012A1300131C282023A291011B16350311A14100283A113001A375016A950071A290017A2D502124AB16690268A14600424A
8、136013A378017A1400083A290012A640036A15465968B13500273B129025A350025A1400036A283004A333045B1527014B13050071BC131011A348013A1250071A263022A318071B14770495B12500283C121008A329013A1250070A262007A4D422098A159471031A14167945A108015A364011A1500400AB269029A367004A16430127A14300141A152012B341023A1650154B2990
9、17A335081A155701126A13267693A174025B350022A1300200AC273016A388114A19370769B17933896B162009B379022A1167152C313033A7D481147A17625276A153331101A131030A336046A1567231A287051A548276A171851209A148501485A138037A367018A1600141A314015A464043A17315573A15250212A131002A367019A1500283A309013A466065A17515120A1545
10、0071A136011A348005A1500424A284008A10D305042A161101027A14600954A162016A332023A1167208A281025A976098B16475856A14750495A173003A372013A3250354B276022A323126A16823226A15200265A168019A380008A1500173A304013A491003A16305799A14700000A168030A350021A1200287A277055A13D511172A184901513A17550626A189006AB369031A14
11、001202A334036A531083A18167605A15833208AB179034A362016A1233058A337033A540145A181431218A15033826B198049B389023A1300100A288011A513294A17883224A15900173AB181012AB357014A1250764A292018A16D293027A17453360A15333252A181010A352015A1250321A332035A389085A172801277A154001015A161011A314017A1200200A287023A307126A
12、17027522A14800500A178007A334007A1333115A304021A336088A171232555A154332413A181023A318034A1433208A281054A20D541093A175402456A152332566A170032A338016A1367153A305045A579188A16870846A15500624A173009A315025A1133153A258006A559318A169271299A153501493A158024A312026A1167208A258019A543117A17657221A15733513A176
13、024A352032A1267351A286011A量变化不显著，NA和CL含量急剧下降，均与对照组差异极显著P001；MG含量发生了变化，实验组显著低于对照组P005，与实验组、之间存在显著差异P005；FE含量持续升高，实验组与对照组差异显著P005，实验组与对照组差异极显著P001，实验组与实验组之间存在显著差异14P005。7D后，大黄鱼血清中各电解质含量变化不大，只在10D和13D有12个电解质含量出现个别差异。3讨论31弧菌感染对大黄鱼血液红细胞的影响一般认为，由于疾病的影响，鱼类的红细胞形状、大小及数量均会发生变化，常引起贫血症状的出现。本实验结果与此相似，在感染致病弧菌后的12
14、D内，各实验组的红细胞数量均显著低于对照组，说明在三种致病弧菌感染初期，由于鱼体受到刺激和伤害，大黄鱼红细胞会有一定的损伤，数量会有一定程度的降低。这与天然感染迟缓爱德华氏菌EDWARDSIELLATARDA或者注射分枝杆菌的罗非鱼，都观察到红细胞数量的下降一致108。但与YANQP等20对大黄鱼注射溶藻弧菌后，发现感染初期大黄鱼红细胞数量会有一定程度的增加不一致，笔者认为可能与试验菌株、感染浓度、注射剂量的差异相关，从而导致鱼体应激和免疫反应的时效差异。感染4D后各实验组红细胞数量开始升高，特别是溶藻弧菌感染组极显著高于对照组。反映大黄鱼在经过免疫应激后已通过自身免疫机能机体逐渐恢复，据相关
15、报道鱼类的红细胞还具有吞噬功能，表明红细胞免疫功能在鱼类免疫防御中占有重要地位。32弧菌感染对大黄鱼血液白细胞的影响在鱼类免疫过程中，血液中白细胞数量的多少可直接反映出鱼类非特异性免疫能力的高低21。在脊椎动物防御外来病原体的过程中，常可见到白细胞增殖的现象710。本实验结果表明，各实验组大黄鱼在感染后的17天内白细胞数量变化较为明显，实验组大黄鱼受感染后第1天白细胞数量略低于对照组，但2D后白细胞数量开始急剧上升与对照组差异极显著，这说明染病初期病原菌的侵入刺激了鱼的代偿性应激引起大黄鱼白细胞的增殖；但4D后，白细胞数量开始显著下降，可能是由于大量的菌体抑制血液中白细胞的生成，对白细胞产生损
16、害，从而白细胞数目减少。7D以后，各实验组白细胞数量又有增加的趋势，这可能是由于大黄鱼自身机体通过与病原菌相互作用后其免疫系统逐渐恢复。13D以后各组患病大黄鱼通过自我修复逐渐正常，因此白细胞数量趋于一致，无显著变化。鱼类白细胞数量及形态变化，在一定程度上反映其造血机能及与疾病的相对关系。根据资料表明，当病原入侵时，鱼类由于受到刺激导致造血机能和体液防御机能相对增强，其白细胞数会明显增多，如患败血症和狂游症的鲢2223，但陈福华等24认为当疾病进入后期，患病鱼体能变弱，造血机能和体液防御机能也相应减弱，此时的白细胞数量也随之减少，在本实验结果中也出现了这一趋势。大黄鱼受感染后白细胞数量的变化具
17、有一定的规律性，总体上随时间的延长先升高后降低，具有明显的时间效应。这与孙峰9以及鄢庆枇12等有关鱼类抗感染时非特异性免疫作用的相关研究结果相似。不同菌种之间对大黄鱼的影响也存在差异，就白细胞数量变化而言，试验结果显示哈氏弧菌感染组变化幅度最大，可能与哈氏弧菌菌株的毒性较强有关。白细胞中的粒细胞、单核细胞以及淋巴细胞都与机体的抗感染免疫密切相联，其中的中性粒细胞和单核细胞具有较强的吞噬作用，而单核细胞渗出血管后进入组织和器官，可进一步分化发育成巨噬细胞而具有最强的吞噬能力，它们是机体非特异性免疫的重要组成部分。因此，测定鱼类血液中白细胞的组成及其吞噬活性，可以反映被测鱼体的免疫状态。本试验对感
18、染后不同天数内各实验组和对照组大黄鱼血液中的白细胞各成分比例及吞噬活性变化进行了检测。结果显示，白细胞中包含有淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞以及嗜酸性粒细胞，偶尔发现嗜碱性粒细胞。正常大黄鱼中性粒细胞最多，其次是淋巴细胞和单核细胞，嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞极少。在感染后的14D内大黄鱼血液中白细胞各成分比例变化较为明显，12D内各实验组淋巴细胞百分比呈显著下降趋势，2D后各实验组淋巴细胞百分比有所升高，7D以后，各实验组淋巴细胞的比例逐渐恢复变化不明显。这与前述感染初期实验组白细胞总数减少的趋势相一致，其中主要是淋巴细胞减少所致。由于鱼类淋巴细胞也像高等脊椎动物那样能被抗原激活而产生相应的抗
19、体和淋巴因子，而感染初期鱼体内抗体尚未产生，因此淋巴细胞数量较低。淋巴细胞减少现象在许多鱼类的应激反应中都有出现2526，情况比较复杂。单核细胞存在于所有脊椎动物中，环境污染和疾病感染都能引起鱼类血液中单核细胞数目显著增加，本实验结果与之相符。单核细胞比例在感染后的14D内均呈上升趋势，12D内上升幅度最大，说明大黄鱼受感染过程中能引起单核细胞的增殖。鱼类中性粒细胞具有活跃的吞噬和杀伤功能，RANZANIPAIVAMJT等10的研究表明尼罗罗非鱼在受分枝杆菌MYCOBACTERIUMMARINUM感染后的1D白细胞就开始增加，其主要是中性粒细胞增殖所致。本实验在感染后的14D内却出现不同程度的
20、下15降，没有随着白细胞数量的增加而同步增加，与鄢庆枇等12研究结果相同，鄢庆枇等认为可能是由于粒细胞具有趋化性和吞噬作用，所采用的腹腔注射会导致大量的粒细胞因趋化作用而在病原菌聚集的腹腔聚集，从而引起外周血中粒细胞数量下降，同时吞噬作用也会引起部分粒细胞死亡，进一步导致外周血中粒细胞数量的下降。笔者认为除上述原因外还可能与鱼种差异、不同菌种、计数方法等有关。嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞由于本身存在数量很少，实验中其数量变化波动不大，仅在2D时溶藻弧菌感染组的嗜酸性粒细胞显著高于对照组。嗜酸性粒细胞的功能目前了解较少，但它具有吞噬功能是明确的，在急性组织损伤或病原感染时，病灶部位常有大量的嗜酸性
21、粒细胞聚集，它能非特异性地吞噬病原和伤亡的自身组织。笔者也发现患病鱼体血液中曾出现大量的嗜酸性粒细胞聚集。33弧菌感染对大黄鱼免疫细胞的影响在鱼类血细胞中，吞噬细胞、中性粒细胞、巨噬细胞都具有吞噬异物的能力，是鱼类非特异性免疫系统中的主要指标之一，它们在吞噬过程中可产生活性氧，对于入侵的病原体有很大的杀伤力，可独立或与其它溶酶体酶类协同地发挥作用27。NBT是研究这类细胞数量和吞噬能力的极好指示剂，在活性氧产生过程中，胞质中的葡萄糖6磷酸被氧化，所脱下的氢被NBT所接受，因此细胞可将渗入的NBT由淡黄色还原为棕黑色或深蓝色，这个反应已成为鱼体健康状况或者免疫增强剂效果评定的有效参考指标28。本
22、实验中NBT阳性细胞就是这三种细胞的总称17，因此NBT阳性细胞可综合反映鱼类血液中吞噬细胞、中性粒细胞、巨噬细胞的水平和功能，它们的数量以及吞噬能力的高低可直接反映鱼类非特异性免疫能力的大小。SHARIFFM等29用嗜水气单胞菌AEROMONASHYDROPHILA感染爪哇鲤鱼后提高了吞噬细胞的NBT反应活性。本实验结果也表明，各实验组大黄鱼外周血的NBT阳性细胞数量在感染后的24D极显著升高，尤其是哈氏弧菌感染组中NBT阳性细胞数目在短时间内出现了明显增加，这与白细胞数量变化趋势类似，说明感染初期病原菌已经进入了鱼体的血液循环，刺激鱼体的免疫系统，导致处于吞噬后杀菌状态的吞噬细胞、中性粒细
23、胞、巨噬细胞等数量及活性有显著的提高。7D后各实验组NBT阳性细胞数量与对照组趋于一致，表明清除外来病原或异物的任务已基本完成。大黄鱼血液中吞噬细胞的吞噬功能测定结果也显示，在感染后的14D内各实验组的吞噬百分比PP变化与NBT阳性细胞数量变化趋势类似。而吞噬指数PI的变化不完全随吞噬百分比的变化而变化，这是因为血液吞噬细胞百分比的增加可能是机体在应激情况下的一种自我保护措施，但数量和百分比的增加并不总是伴随着吞噬能力的增加。研究表明，哈氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌对大黄鱼血细胞免疫功能的影响主要发生在感染后的14D内，各类细胞的数量和活性均呈现出明显的变化，反映鱼体受感染后从应激反应发生至免
24、疫细胞发挥作用主要集中在前几天，为确定免疫增强剂使用的合理时间以及阐明大黄鱼血细胞的免疫作用机理提供了实验依据。三种致病弧菌对大黄鱼各项非特异性血细胞免疫指标的影响趋势基本一致，但不同病原之间也存在一定的差异，哈氏弧菌在白细胞数量、NBT阳性细胞数量等多个指标上的变化最明显，对大黄鱼的影响作用亦较强，说明哈氏弧菌较溶藻弧菌和副溶血弧菌而言毒性较强。34弧菌感染对大黄鱼血液生化指标的影响糖、脂肪和蛋白质是鱼类能量的根本来源，其中葡萄糖是许多组织所必须的燃料。血液中各项物质的相对稳定对鱼类正常的生命活动有着十分重要的作用。从本研究结果看，大黄鱼受感染后与对照组相比各实验组在多项血清生化指标上均发生
25、了显著的变化。血清中蛋白质分为两种，一种是白蛋白也称清蛋白，另一种是球蛋白。白蛋白可以修补组织，维持血浆胶体渗透压；血清球蛋白，尤其是球蛋白是免疫性抗体参与机体特异性免疫；两者结合起来称之为血清总蛋白。血清蛋白可以用来诊断鱼类的健康、营养和疾病情况。本实验中蛋白质类物质含量的变化主要发生在感染后2D，TP、ALB、GLOB值都有升高的趋势，这与周玉等30的研究结果相似，具体的病理意义有待于进一步的研究。谷丙转氨酶和谷草转氨酶在糖、蛋白质和脂肪三大物质代谢过程中起着十分重要的作用，是生命体正常生命活动不可缺少的酶类之一。血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶的含量因鱼的种类而有一定的差异，正常状态下，它们
26、主要存在于细胞中，在心脏和肝脏中活性较高，在血清中活性一般较低。当组织细胞受损时，大量转氨酶溢出进入血液，血清中的含量迅速上升。目前，医学上把血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性的变化作为心肌梗死和急性肝炎的诊断和预后指标之一。对于鱼类，尾崎久雄等31曾调查了鳗鲡血清16中谷草转氨酶和谷丙转氨酶的活性对肝脏的影响；周玉等30也曾报道欧洲鳗鲡患“狂游病”后，转氨酶含量显著升高，认为是肝脏组织受到损伤引起。本实验中血清酶类的含量变化主要发生在感染后的17D，ALT、AST、LDH等酶含量在感染后的17D内出现不同程度的上升，而血糖、胆固醇等含量有所下降。由于AST、ALT、LDH等血清酶类主要分布于机
27、体的肝、肌肉等组织细胞中，正常情况下血清中这些酶活性较低且相对恒定，上述结果说明大黄鱼受感染后肝、肌肉等组织受到了损伤，细胞内酶大量溢出，机体糖、脂肪、蛋白质等物质代谢发生障碍，导致血清中酶的含量迅速上升，与陈寅儿等32的研究结果一致。血清中的尿素、肌酐、K、NA、CL等的含量是肾功能指标，含量变化说明鱼体肾单位滤过及重吸收功能失调，肾功能不全。血清总蛋白、尿素、肌酐等含量的上升，显示鱼体严重脱水、血液浓缩、肾脏机能发生障碍，这与病鱼分泌大量粘液的现象也相符合。米瑞芙等23报道患败血症的鲢血清中尿素氮和肌酐显著增加而钾、钠、氯化物浓度极显著降低。也有研究报道患溶血性腹水病的异育银鲫血清中肌酐显
28、著增加而钠和氯化物浓度极显著降低，说明两者均表现出肾功能减退或肾功能不全的症状。本实验中，各实验组大黄鱼血清中尿素氮和肌酐含量并没有显著增加，在感染后1D时尿素氮略为上升与对照组差异不明显，之后各感染组基本含量呈下降趋势略低于对照组，说明本研究中各实验组患病大黄鱼并未出现严重的肾组织损伤和肾功能衰退。K、NA、CL1等含量的变化反映了肾小球的滤过与重吸收功能失调，肾脏机能减弱，而且当机体处于肾脏功能减退时，还可引起血清无机磷滞留，使血清无机磷增加33。本试验中，各感染组血清中K、NA、CL等电解质离子在感染后的14D内发生了变化，主要表现为高K、FE，低NA、CL，P、CA、MG无显著变化，说
29、明本研究中各实验组大黄鱼在受到感染后的14D内肾脏机能有所减弱，但肾功能并没有衰退。在感染7D后各组含量基本趋于一致无显著差异，说明鱼体可以通过自身免疫系统的作用清除病原菌逐渐恢复肾功能。这与陈寅儿等32研究鲈鱼感染溶藻弧菌后肝、肾、肌肉等组织严重受损以及郑天伦等34对大黄鱼“溃疡病”研究结果有所出入，可能原因在于感染的剂量和浓度不同致使致病程度不同有关，本实验的感染浓度和剂量是以实验鱼体受感染但无明显外部症状和死亡为原则设计的。本研究还表明，三种致病弧菌在血清生化指标变化趋势上虽然基本一致，但各种菌在病程时效和变化程度上有所差异。哈氏弧菌组在感染后12D内血清中AST、ALT、LDH、K、N
30、A、CL等含量已发生了显著变化，而溶藻弧菌及副溶血弧菌主要在24D内出现相关指标的升高或降低，说明哈氏弧菌的毒性较强能引起鱼体急性反应。研究表明，实验期间大黄鱼血液中生化组分的显著变化主要发生在病原菌感染前期，尽管生化组分变化对大黄鱼组织器官的生理机能和代谢水平产生影响，但未造成其肝脏、肾脏等器官的严重病变，鱼体能通过自身免疫系统的作用和调节来防御病原细菌感染，最终修复损伤并恢复正常生理机能。参考文献1吴后波,潘金培弧菌属细菌及其所致海水养殖动物疾病J中国水产科学,2001,8189932林克冰,周宸,刘家富,等海水网箱养殖大黄鱼弧菌病的病原菌J台湾海峡,1999,18303423473鄢庆枇
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36、SJCHINESEJOURNALOFOCEANOLOGYANDLIMNOLOGY2009,27859121孙建和,严亚贤,陈怀青,等鲫鱼的细胞免疫应答研究J上海农学院学报,1998,162899122余毅,吴宝华白鲢疯狂病血液的研究A中国水产学会第四次全国会员代表大会暨学术年会论文集C1988,20020323米瑞芙,陶烦春,王晓梅,等鲢败血症血液生理指标的变化J淡水渔业,1993,234161924陈福华,陈毕生,杨莺莺,等赤点石斑鱼增生性肾脏病的血液病理观察J热带海洋,1997,163495325王文博,李爱华,环境胁迫对鱼类免疫系统影响的研究概况J水产学报,2002,2643683742
37、6王文博,汪建国,李爱华,蔡桃珍拥挤胁迫后鲫鱼血液皮质醇和溶菌酶水平的变化及对病源的敏感性中国水产科学J,2004，11540841227GRANTJJ,LOAKEGJROLEOFREACTIVEOXYGENINTERMEDIATESANDCOGNATEREDOXSIGNALINGINDISEASERESISTANCEJPLANTPHYSIOL,2000,124213028ANDERSONDPIMMUNOSTIMULANTS,ADJUVANTSANDVACCINECARRIERSINFISHAPPLICATIONTOAQUACULTUREJFISHDISEASES,1992,228130729
38、SHARIFFM,JAYAWARDENAPA,YUSOFFFM,ETALIMMUNOLOGICALPARAMETERSOFJAVANESECARPPUNTIUSGONIONOTUSBLECKEREXPOSEDTOCOPPERANDCHALLENGEDWITHAEROMONASHYDROPHILAJFISHSHELLFISHIMMUNOL,2001,1128129130周玉,郭文场,杨振国,等欧洲鳗鲡”狂游病”血液生化指标研究水生生物学报,2002,26331431631尾崎久雄鱼类消化生理M上海科技出版社,1983,第一版2552258032陈寅儿,金珊,王国良鲈鱼溶藻弧菌病的血液生理生化指标研究J台湾海峡,2005,24110410833陶义训临床生化检验上M上海上海科学技术出版社,1979,10622334郑天伦,王国良,黄家庆,等养殖大黄鱼溃疡病的病原菌及其防治药物J浙江大学学报理学版,2006,335573577
