1、 本科毕业论文 （ 20 届） 东海陆架沉积物可培养微生物多样性研究 所在学院 专业班级 生物科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 本科毕业论文 目录 目录 摘要 .错误 !未定义书签。 Abstract . II 引言 . 1 1 材料与方法 . 2 1.1 样品的采集 . 2 1.2 菌种的分离 . 2 1.2.1 海洋放线菌的分离培养 3： . 2 1.2.2 海洋细菌的分离培养： . 3 1.2.3 海洋真菌的分离培养 4 . 4 1.2.4 微生物平板菌落计数 5 . 5 1.2.5 菌株纯化 6 . 5 1.2.6 菌种保存（液体石蜡法） 10 . 6 1.3 对
2、菌种的分子鉴定 . 6 1.3.1 对保存的菌种活化 . 6 1.3.2 菌种总 DNA的提取和电泳检测 . 6 1.3.3 对总 DNA 进行 PCR扩增和电泳检测 . 7 1.3.4 测序 . 7 1.3.5 序列分析 . 7 2 实验结果与分析 . 8 2.1 微生物的分离 . 8 2.1.1 微生物的分离结果 . 8 2.1.2 微生物的计数结果 . 9 2.1.3 微生物的菌落特征 . 14 2.2 微生物的分子鉴定 . 16 2.2.1 总 DNA提取的电泳检测结果 . 16 2.2.2 16S rDNA基因序列扩增的电泳检测结果 . 17 2.2.3 16S rDNA基因测序及系
3、统进化分析 . 17 3 讨论 . 21 3.1 关于不同培养基的培养效果的讨论 . 21 3.2 关于海洋微生物的 分离培养方法的讨论 . 21 3.3 关于人工培养与非培养的讨论 . 22 参考文献 . 24 附译文 .错误 !未定义书签。 本科毕业论文 目录 附译文原文 .错误 !未定义书签。 致谢 .错误 !未定义书签。 本科毕业论文 中文摘要 I 摘要 摘要 本文主要采用不同的培养基对东海陆架沉积物中的海洋微生物进行分离；然后将分离纯化到的海洋微生物 进行 16S rDNA基因扩增和测序 ；最后分析序列并构建系统发育树。实验表明：第一，从沉积物中共分离到 272株微生物，其中 MR2
4、A培养基分离到 97株，蛋白胨琼脂培养基分离到 57株， AMM培养基分离到 22株， PDA培养基分离到28株， Zobell培养基分离到 36株，高氏一号培养基分离到 12株，纯海水培养基分离到 20株。 MR2A培养基、蛋白胨琼脂培养基更适合海洋微生物的筛选。第二，从有效的 60株微生物序列中有 43株为芽孢杆菌属（ Bacili）， 13株葡萄球菌属（ Staphylococcus）， 1株洛菲不动杆菌（ Acinetobacter lwoffii）， 1株 成团泛菌（ Pantoea agglomerans）， 1株 正青霉属（ Eupenicillium），还有 1株与 Blast
5、比对绝大多数是未培养克隆，因此可能会是 新种。研究 为初步认识了解东海陆架沉积物中的可培养微生物奠定了基础。 关键词 东海陆架沉积物；可培养微生物；筛选； 16S rDNA 的分子鉴定 本科毕业论文 英文摘要 II Abstract Abstract: In this paper, marine microbiology were isolated using different culture media from the East China Sea continental shelf sediments of marine organisms； and then16S rDNA ampl
6、ification, gene sequencing; Finally, sequence analysis and phylogenetic tree. The results show that first the 272 microorganisms were isolated from the sediment，including 97 strains from MR2A medium, 57 strains from peptone agar medium, 22 strains from the AMM medium, 28 strains from the PDA medium,
7、 36 Strains from the Zobell medium,. 12 strains from the Gao medium, 20 strains from the medium of pure water. MR2A medium, peptone agar medium is more suitable for the culture of marine microorganisms. second we recognize 60 strains of microbiology from the effective sequence. 43 strains of Bacilli
8、, 13 strains of staphylococcus,1strain of Acinetobacter lwoffii,1strain of Pantoea agglomerans, 1strain of Eupenicillium sp. Last one Was Uncultured clone Comparison with Blast. so it May be a new species. This Research is foundation to find out the culture marine microbiology of sediments of East C
9、hina Sea continental shelf. Key words: Sediments of East China Sea shelf； Culturable microbiology； Filter； Identification of 16S rDNA 本科毕业论文 引言 1 引言 海洋占整个地球表面积的 70%，其中蕴藏着丰富的海洋微生物资源，是 21世纪亟待开发和利用的巨大宝藏。海洋中存在着许多自然条件特殊的环境，如低温、高温、高压、高盐、强酸、低营养和低浓度溶解氧等环境，一般的海洋生物无法在其中生存，只有某些具备特殊生理和遗传特性的微生物，如嗜冷微生物、嗜压微生物、嗜盐微生
10、物、嗜 酸微生物、寡营养微生物和嗜热古细菌，才可以在这类环境中生长和代谢 1，因而在物种、基因组成和生态功能上具有多样性，是整个生物多样性的重要组成部分。 近年来 ,海洋微生物多样性研究及其在海洋生态系统中的作用越来越受到海洋科学家的重视。但是目前仍然有相当数量的海洋微生物尚未被我们发现 ,对海洋微生物的丰度、分布规律等也缺乏系统的了解。海洋微生物群落的结构组成和特性在一定程度上反映了海洋生态系统的环境状况 。对海洋微生物群落结构空间变化的研究不但能够揭示海洋环境中微生物群体的生态学特征，而且还能为分析生态环境的历史变 革等情况提供线索。 海洋微生物不仅在海洋生态环境保护、地球物质循环和能量转
11、换等方面具有非常显著的作用 , 而且能够为人类提供种类繁多、分子结构新颖、化学组成复杂和生理活性特异的海洋天然产品 ,是海洋药物、保健食品和生物材料的巨大宝库。因此保护和拯救海洋微生物多样性是实现人类可持续发展的基础。 随着海洋微生物纯培养技术的发展，高通量培养法、扩散盒培养法和微囊包埋法等新方法促进了更多新的海洋微生物纯培养菌株的发现 2，同时 聚合酶链式反应 (PCR) 、16SrRNA 序列分析以及 ARDRA(Amplified rDNA Restriction Analysis) 等现代分子生物学技术 的应用，为海洋微生物的研究提供了基础。因此本课题主要从东海陆架沉积物可培养微生物多
12、样性研究来初步认识了解海洋微生物。本科毕业论文 材料与方法 2 1 材料与方法 1.1 样品的采集 采用多管采样器采集 13 号站点的表层沉积物柱状样品（ 0-10cm），根据层次不同依次编号：编号： 131， 132， 133， 134（取样深度分别为水 -沉积物界面以下 03cm，35cm， 58cm， 810cm），船上 -20冰箱保存，回实验室后进行样品分装，将样品分装为 5ml（ 2 管）和 10ml（ 1 管）冻存管，等，然后在 -72 超低温冰箱中保存，以备后续实验使用。 表 1 样品采集位点 Tab1 Sampling site 柱样号 采样日期 采样时间 层次 水深 /m 纬
13、度 经度 13# 20070425 02： 00 0 3cm； 35cm ； 5 8cm ； 8 10cm 40 31 30.103N 123 29.844 E 1.2 菌种的分离 1.2.1 海洋放线菌的分离培养 3： 预处理： 将样品放在 120 烘箱，时间 1h,然后称取 1g，加入盛有 99ml 灭菌陈海水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，摇床振荡 30min（ 28 ， 160r/s） ，使样品与水充分混合。 稀释：用一支 1ml 无菌吸管从中吸取 1ml 悬浮液加入 9ml 无菌海水的试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取 1ml 加入另一盛有 9ml 无菌海水的试管中，以此类推制成
14、 10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释度的溶液（注意无菌操作）。 涂布：在蛋白胨琼脂培养基的九个平板底面分别用记号笔写上 10-2,10-3,10-4 三种稀释度（每种稀释度做三个平行组用于计数平均），然后用无菌吸管分别由 10-2,10-3,10-4 三管样品稀释液中各取 0.1ml 对号放 入已写好稀释度的平板中，用无菌涂布棒在培养皿表面轻轻涂布均匀，室温下静置 10min。平板倒置 25 培养 3 7 天。（也可用已灭菌的移液枪和一次性枪头来操作） 本科毕业论文 材料与方法 3 ( )原蛋白胨琼脂培养基： 葡萄糖 10g，蛋白胨 2g，酵母膏 1g，琼脂 1
15、5 20g，陈海水 1000ml, pH 7.5， 115 灭菌 25min；灭菌后添加 0.005%重铬酸钾抑制剂， 10 滴 /250ml。 稀蛋白胨琼脂培养基： 葡萄糖 1g，蛋白胨 0.2g，酵母膏 0.1g，琼脂 15 20g，陈海水 1000ml, pH 7.5， 115 灭菌 25min；灭菌后添加 0.005%重铬酸钾抑制剂， 10 滴 /250ml。 ( ) 原高氏一号培养基 (GAU)： 可溶性淀粉 20g, KN03 1g, K2HP04 0.5g, MgS04.7H20 0.5g, FeS04.7H20 0.01g，琼脂 15 20g，陈海水 1000mL, pH 7.
16、2 7.4。 稀高氏一号培养基 (GAU)： 可溶性淀粉 2g, KN03 0.1g, K2HP04 0.05g, MgS04.7H20 0.05g, FeS04.7H20 0.001g，琼脂 15 20g，陈海水 1000mL, pH 7.2 7.4。 配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至 1000ml， 121 灭菌 20min。 ( ) 原 AMM 培养基： 琼脂 18g ，可溶性淀粉 10g，酵母浸膏 4g，蛋白胨 2g，陈海水 1000ml， pH 自然。 稀 AMM 培养基： 琼脂 18g ，可溶性淀粉 1g，酵
17、母浸膏 0.4g，蛋白胨 0.2g，陈海水 1000ml， pH自然。 最后再配制一种全海水培养基：琼脂 18g，陈海水 1000ml， PH 自然。 1.2.2 海洋细菌的分离培养： 预处理：称取研碎的样品各 1g，加入盛有 99ml 灭菌陈海水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，摇床振荡 30min（ 20 ， 160r/s） ，使样品与水充分混合。 稀释：用一支 1ml 无菌吸管从中吸取 1ml 悬浮液加入 9ml 无菌海水的试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取 1ml 加入另一盛有 9ml 无菌海水的试管中，以此类推制成 10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释
18、度的溶液（注意无菌操作）。 涂布：在下列两种培养基（ Zobell 2216E 培养基和 MR2A 培养基）的各九个平板底面分别用记号笔写上 10-4,10-5,10-6 三种稀释度（每种稀释度做三个平行组用于计数平均），然后用无菌吸管分别由 10-4,10-5,10-6三管样品稀释液中各取 0.1ml 对号放入已写好本科毕业论文 材料与方法 4 稀释度的平板中，用无菌涂布棒在培养皿表面轻轻涂布均匀，室温下静置 10min。平板倒置 25 培养 24 48h。 ( )原 Zobell 2216E培养基： 蛋白胨 5g，酵母浸膏 1g，磷酸铁 0.01g，琼脂 15 20g， 蒸馏水 250 m
19、l, 陈海水 750 ml, pH 7.2， 121 灭 菌 20min； 稀 Zobell2216E培养基： 蛋白胨 0.5g，酵母浸膏 0.1g，磷酸铁 0.001g，琼脂 15 20g， 蒸馏水 250 ml, 陈海水 750 ml, pH 7.2， 121 灭菌 20min； ( )原 MR2A(Difco)培养基 : proteose peptone朊蛋白胨 0.5 g, 酵母浸膏 0.5 g, 酪蛋白氨基酸（水解酪蛋白） 0.5 g, 葡萄糖 0.5 g, 可溶性淀粉 0.5 g, 丙酮酸钠 0.3 g, K2HPO4 0.3 g, MgSO47H2O 0.05 g, 琼脂 15
20、g, 蒸馏水 500 ml, 陈海水 500 ml, pH 7.2。 稀 MR2A（ Difco）培养基： proteose peptone朊蛋白胨 0.05 g, 酵母浸膏 0.05 g, 酪蛋白氨基酸（水解酪蛋白）0.05 g, 葡萄糖 0.05 g, 可溶性淀粉 0.05 g, 丙酮酸钠 0.03 g, K2HPO4 0.03 g, MgSO47H2O 0.005 g, 琼脂 15 g, 蒸馏水 500 ml, 陈海水 500 ml, pH 7.2。 最后再配制一种全海水培养基： 琼脂 18g，陈海水 1000ml， PH自然。 1.2.3 海洋真菌的分离培养 4 预处理：称取研碎的样品
21、各 1g，加入盛有 99ml 灭菌陈海水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，摇床振荡 30min（ 20 ， 160r/s） ，使样品与水充分混合。 稀释：用一支 1ml 无菌吸管从中吸取 1ml 悬浮液加入 9ml 无菌海水的试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取 1ml 加入另一盛有 9ml 无菌海水的试管中，以此类推制成 10-1,10-2,10-3,10-4 不同稀释度的溶液（注意无菌操作）。 涂布：在下列几种培养基的各九个平板底面分别用记号笔写上 10-2,10-3,10-4 三种稀释度（每种稀释度做三个平行组用于计数平均），然后用无菌吸管分别由 10-2,10-3,10-4 三管样品稀
22、释液中各取 0.1ml 对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌涂布棒在培养皿表面轻轻涂布均匀，室温下静置 10min。平板倒置 20 培养 3 5 天。 ( )原马铃薯蔗糖琼脂培养基 (PDA)： 马铃薯 200g，琼脂 25g，蔗糖 20g，陈海水 1000ml 1. 将马铃薯削皮，切成小块，放在水中（马铃薯：水 1： 5）煮沸 30min，然后用纱本科毕业论文 材料与方法 5 布过滤，加入 20g 蔗糖 2. 将琼脂称出剪碎放入 烧杯中加水煮沸，全部溶化后，同混合，加陈海水补足至1000ml,121 灭菌 30min。 稀马铃薯蔗糖琼脂培养基 (PDA)：马铃薯 20g，琼脂 25g，蔗糖
23、2g，陈海水1000ml 1将马铃薯削皮，切成小块，放在水中（马铃薯：水 1： 5）煮沸 30min，然后用纱布过滤，加入 2g 蔗糖 2.将琼脂称出剪碎放入烧杯中加水煮沸，全部溶化后，同混合，加陈海水补足至1000ml,121 灭菌 30min。 1.2.4 微生物平板菌落计数 5 一般选择每个平板上有 30-300 个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量比较合适。 每毫升中菌落形成单位（ cfu） =同一稀释度三次重复的平均菌落数 x 稀释度 x100 1.2.5 菌株纯化 6 一、 将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述几种培养基的斜面上（注意在挑取的菌落部位用记号笔划个小圆圈做记号
24、，避免重复挑取），分别置于 20温室培养，待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色（革兰氏染色法）后用显微镜检查是否为单一的微生物，若发现有杂菌，需再一次进行分离纯化，直到获得纯培养。 二、采用划线法纯化 7，即用接种环挑取一环菌体在平板的一边，作第一次平行划线 2-3 条，转动培养皿约 70。用在火上烧过并冷却的接种环，通过第一次划线部分，作第二次平行划线。用同样的方法通过第二次平行划线部分，作第三次平行划线。划线完毕后将平板倒置于 20 恒温箱中培养。大约培养 2 5 天，即刚刚长成小菌落时挑取单菌落进行反复纯化。 三、根据平板上放线菌的鉴别依据对平板的菌落进行鉴别 8。将初步确认的单个放线菌菌落挑取划线接种于高氏一号培养基平板上， 25 纯化培养 3 5 天。此时，初步认为放线菌已 分 离纯化，挑入高氏一号斜面培养基中，短期保藏供后续实验用。 平板上放线菌的鉴别依据 9： (1)菌落有核，以核为 中心，向四周呈放射状分布。特别是菌落表面如确认有菌丝时，至少可与细菌容易区别。 (2)菌落表面褶皱。
