1、 本科毕业论文 （ 20 届） 东海陆架沉积物古菌多样性研究 所在学院 专业班级 生物科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 中文摘要 i 目录 摘要 . i Abstract .ii 引言 . 1 1.材料与方法 . 2 1.1 实验材料 . 2 1.1.1 实验样品 . 2 1.1.2 主要生化试剂（盒） . 2 1.1.3 主要试剂及培养基配制 . 3 1.1.4 实验仪器 . 4 1.2 实验方法 . 5 1.2.1 样品 DNA 的提取 . 5 1.2.2 16S rDNA 基因的 PCR 扩增 . 6 1.2.3 PCR 产物的纯化 . 6 1.2.4 重组载体的构
2、建 . 7 1.2.5 重组载体的转化 . 7 1.2.6 重组子的克隆 . 7 1.2.7 基因文库克隆的鉴定 . 8 1.2.8 系统发育分析 . 8 1.2.9 温度梯度凝胶电泳 (TGGE)分析 . 8 2.结果与分析 . 10 2.1 样品 DNA 的提取 . 10 2.2 16S rDNA 基因扩增与纯化 . 10 2.3 克隆文库的构建与鉴定 . 11 2.4 系统发育分析 . 12 2.4.1 古菌多样性分析 . 12 2.4.2 古菌各类群分布分析 . 14 2.4.3 古菌系统发育分析 . 16 2.5 温度梯度凝胶电泳（ TGGE）结果 . 16 3.讨论 . 17 3.
3、1 实验方法的改进 . 17 3.1.1 16S rDNA 基因扩增体系的优化 . 17 3.1.2 核酸序列分析方法研究古菌多样性的优缺点 . 18 3.2 古菌群落特征分析 . 18 3.2.1 古菌群 落垂直分布特征分析 . 18 3.2.2 古菌多样性分析 . 19 参考文献 . 20 附译文：南海西沙海槽表层沉积物微生物多样性 . 错误 !未定义书签。 附译文原文 . 错误 !未定义书签。 致谢 . 错误 !未定义书签。 中文摘要 i 摘要 摘要 海 底沉积物中蕴含大量的微生物类群，它们是海洋生态系统的重要组成部分。通过对海洋沉积物古菌多样性的研究，有助于人们更深入地了解海洋。 本文
4、利用基于16S rDNA 的分子生物学技 术对东海陆架表层沉积物的古菌进行了研究，结果表明：沉积物中古菌序列分属两个大类： 泉古生菌 (Crenarchaeota) 和广古生菌(Euryarchaeota) 。以 Marine Crenarchaeotic Group I(MG I， 51.1%）和 Miscellaneous Crenarchaeotic Group (MCG， 37.2%)为主要类群，其余还有少量 Marine Benthic Group C (MBGC， 4.3%)、 Marine Benthic Group A (MBGA， 1.1%)和 Anaerobic Metha
5、notrophic Euryarchaeota（ ANME， 1.1%）。 通过研究发现东海陆架沉积物蕴含着大量的古菌资源，同时也为进一步研究海洋沉积物古菌多样性奠定基础。 关键词 东海陆架；沉积物； 16S rDNA；古菌多样 性 英文摘要 ii Abstract AbstractMarine sediments were estimated to contain a huge amount of microbe, which was of great importance to the marine ecology. It would help us explore the ocean b
6、y the analysis of archaeal diversity in sediments. We used molecular technology based on 16S rDNA to study the archaeal community of marine sediments from the East China Sea. The result showed that all the archaea were uncultivable and could be divided into two groups, Crenarchaeota and Euryarchaeot
7、a, respectively. Two archaea groups, Marine Crenarchaeotic Group (MG I， 51.1%)and Miscellaneous Crenarchaeotic Group (MCG，37.2%), were the dominate groups. The remaining were Marine Benthic Group C (MBGC，4.3%) 、 Marine Benthic Group A (MBGA ， 1.1%) and Anaerobic Methanotrophic Euryarchaeota（ ANME， 1
8、.1%） . It revealed that the sediments of the East China Sea contain a large amount of archaea. Meanwhile it would lay a foundation for the deep research. Key words the East China Sea; Sediments; 16S rDNA; archaeal diversity 引言 1 引言 海洋是一个巨大的生态系统，海洋中的各种微生物是构成海洋生态系统的基本元素，而海洋沉积物是海洋历史的见证，在漫长的地质年代里，由河流和大气
9、输入海洋的物质以及人类活动中落入海底的东西，这些物质包括软泥沙、灰尘、动植物的遗骸、宇宙尘埃等 1。海 底沉积物中蕴藏着巨大的生物量，是地球上微生物分布最为丰富的地区，其含量可能占全球生物量 1/10 1/3，甚至达到原核生物量的 65%2。 由于沉积物大部分都位于水面以下数百米甚至数千米，处在一个寒冷、黑暗、高压等特殊的环境中，因此微生物代谢活动很低，然而这种特殊生境对于全球物质循环发挥了重要作用：首先，海洋微生物在深海沉积物的碳、硫循环中作用显著，它们 是甲烷的产生与消耗、硫酸盐的还原和硫化物的氧化的重要部分；其次，由于它们能够释放出甲烷、二氧化碳和硫化氢等温室气体，因此对上层海水乃至全球
10、气候的变化都具有重 要影响；同时微生物的群落结构与环境因子有显著的相关性，是反映海底沉积物环境特征的重要标志物。 海洋微生物生活在高盐、高压、低氧、低光照等极端条件，具有在物种、基因组成和生态功能等方面的多样性，已发现的类群主要包括 : 病毒、古菌、细菌、粘细菌、真核微生物。 然而，由于技术的限制，海底 99%以上的原核生物不可培养，因此无法通过常规手段对其进行深入研究。上世纪八十年代中期，美国科学家 Norman Pace 和他的同事们首先展开了对环境微生物的培养，直接利用环境样品的总 DNA 进行 16S rDNA 的PCR 扩增并进行鉴定 3，开辟了将分子生物学技术直接应用于微生物生态学
11、及多样性研究的新纪元。近年来，由于分子生物学和 PCR 技术的在分类上的应用日益广泛，使得基于 16S rDNA基因的分子生物技术成为研究海底沉积物原核生物多样性的不可替代的手段 2。 古菌是目前生物地球化学研究的热点之一，它们能在各种极端条件下存在，是海洋微生物生态系统的重要组成部分，在全球的生物地球化学作用中扮演重要角色。通过对该领域研究，可以深化对特殊极端环境古菌的研究，揭示生命起源和物种进化，阐明古菌群落与生物地化循环之间的关系，所以对 其研究就有着极其重要的现实意义4,5。 在本文中，我们利用非培养的分子技术研究东海区某站点沉积物（编号 13）中的古菌群落，构建东海古菌 16S rD
12、NA 基因文库，然后对克隆序列进行系统发育分析，研究沉积物中古菌群落的多样性，为生态系统功能的理解和海洋微生物资源的开发利用提供重要的理论指导。 材料与方法 2 1.材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验样品 采用多管采样器采集 13 号站点 的 表 层 沉 积 物 柱 状 样 品（ 0-10cm），根据层次不同依次编号： 编号： 131， 132， 133， 134（取样深度分别为水 -沉积物界面以下 03cm， 35cm， 58cm，810cm）， 船上 -20冰箱保存，回实验室后进行样品分装，将样品分装为 5ml（ 2 管）和 10ml（ 1 管）冻存管，等，然后在 -72超低温
13、冰箱中保存，以备后续实验使用。 图 1.1 13 号样品采集站点位置图 Fig1.1 The location of NO.13 Sample 1.1.2 主要生化试 剂（盒） 土壤核酸快速提取试剂盒 美国 MP Biomedicals 公司 琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司 TaKaRa pMD19-T Vector 试剂盒 宝生物工程（大连）有限公司 TaKaRa Taq 宝生物工程（大连）有限公司 TaKaRa Premix Ex taq 宝生物工程（大连）有限公司 DL2000 DNA marker 宝生物工程（大连）有限公司 DH5感受态细胞 天根生化科技
14、（北京）有限公司 引物 上海生工科技公司 材料与方法 3 1.1.3 主要试剂及培养基配制 * 50TAE 的配制（ 1L） Tris 242g 冰醋酸 57.1ml EDTA（ 0.5mol/L,pH=8.0） 100ml 使用前 50 倍稀释为 1TAE，即可用于琼脂糖凝胶的配制和电泳。 * 6甘油上样缓冲液的配制（ 100ml） 甘油 50ml 1%溴酚蓝 5ml EDTA 30mmol 使用前取 1ml 该溶液，按 1:2000 的比例加入 0.5l SYBR Green I（ invitrogen）核酸染料。 * LB 培养基 （ 1L， pH=7.5） Trypetone 10g
15、Yeast Extract 5g NaCl 10g 向液体培养基中加入 15g/L 琼脂粉即为 LB 固体培养基；向培养基中加入 300l 20%（ 200mg/ml） 氨苄青霉素即为 Amp 抗性 LB 培养基。 * X-gal贮液 将 X-gal粉末溶解于二甲基亚砜 （ DMSO） 中，配成 20mg/mL 的贮液，分装后避光保存于 -20 以备使用，无须过滤或灭菌。 * IPTG 溶液 将 IPTG 粉末溶于无菌水中，配成 200mg/mL 的溶液，分装后保存于 -20 以备使用，无须过滤或灭菌。 * 丙烯酰胺（ 40%， 37.5:1） 将 38.96g 的丙烯酰胺，以及 1.03g
16、的甲叉双丙烯酰胺溶于双蒸水中，定容到100ml，过滤后备用。 * 固定液（ 10%乙酸， 30%乙醇） 将 100ml乙酸， 300ml乙醇用双蒸水定容到 1000ml。 材料与方法 4 * 敏化液（ 30%乙醇） 将 300ml乙醇用双蒸水 定容到 1000ml。 * 银染液（ 0.1%AgNO3）（新鲜配制） 先配制 20%母液，将 2g AgNO3 溶解于双蒸水中，定容到 10ml，放置于棕色瓶中密闭保存。每次使用时，取 2ml 母液，稀释到 400ml，再加入 400l福尔马林溶液（ 37%甲醛）。 * 显影液 溶液 1：溶解 2gNa2S2O3 于双蒸水中，定容到 10ml。 溶液
17、2：溶解 10mlNa2CO3 于双蒸水中，定容到 400ml。 使用时，将 400l溶液 1 加入到溶液 2 中，再加入 400l的福尔马林溶液。 * 终止液 溶解 5.84g EDTA2Na2H2O 以及 8g 甘氨酸于双蒸水中，定容到 400ml。 1.1.4 实验仪器 快速核酸提取仪 Fast Prep24（ MP Biomedicals， US） PCR 仪 T-Gradient（ Biometra， Germany） TGGE 系统 Biometra(German） 冷冻离心机 艾本德中国有限公司 Eppendorf 5417R 移液器 艾本德中国有限公司 电泳仪 北京市六一仪器厂
18、 DYY-6C 型 超净工作台 苏州市洁净技术设计所 SW-CJ-IFD 型 电热恒温振荡水槽 上海精宏实验设备有限公司 DK2-2 型 台式恒温震荡培养箱 江苏太仓培英一起有限公司 HZP-250 型 电热恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司 DNP-9272 型 隔水式恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司 GNP-9160 型 超低温冰箱 日本三洋 SANYO， MDF-382E 高压蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司医疗设备 YXQ-LS-S 凝胶成像系统 GD 2000（ BIO-RAD， USA） 冰箱 西门子（中国）有限公司 BCD-226 材料与方法 5 1.2 实验方法 1.2.
19、1 样品 DNA 的提取 采用土壤中核酸快速提取试剂盒（ Fastprep24 Soil DNA kit， MPBIO）提取沉积物131、 132、 133、 134 的环境基因组总 DNA。提取步骤按照试剂盒说明进行，具体如下： 1） 将 500mg 土壤样品加入 Lysing Matrix E 裂解管中。 2） 加入 978ul的磷酸缓冲液 Sodium Phosphate Buffer 到 Lysing Matrix E裂解管中。 3） 加入 122ul的 MT 缓冲液。 4） 在快速核酸提取仪中，以 6.0m/s 的速度对样品进行提取，时间持续 40 秒。 5） 14000 g 离心
20、5 10 分钟，去除残片。 （注：离心时间延长至 15 分钟，可以去除大的样品中多余的残片，或是有利于从复杂的细胞壁中分离细胞） 6） 将上清转移到干净的 2ml 离心管中，加 250ul PPS（蛋白质沉淀液），用手拿住管子上下摇晃 10 次。 7） 14000 g 离心 5 10 分钟，去除残片。将上清转移到干净的 15ml 离心管中。 （注：这一步用 2ml 的离心管也可以，但是大的管子对 DNA 混合和附着更为有效） 8） 将 Binding Matrix溶液混匀，加入 1.0 ml Binding Matrix溶液到含上清的 15 ml离心管中。 9）将离心管放在漩涡振荡器上，或者放
21、在手上颠倒摇匀 2分钟；将离心管放在管架上静置 3分钟，等待硅石沉淀。 10）小心将 500ul的上清移除，注意不要碰到附着的颗粒沉淀。 11）在剩下的上清液中将 Binding Matrix重悬，将大约 600ul的混合液加入 SPIN滤膜中， 14000 g离心 1分钟，将截留管 catch tube倒空，加入剩下的混合液到 SPIN滤膜，重新离心 1次，将截留管 catch tube再次倒空。 12）加入 500ul准备好的 SEWS-M液体，用枪头吸取液体，轻轻的将小球重悬。 （注：确保乙醇已经加入 SEWS-M浓缩液中） 13） 14000 g 离心 1 分钟，将截留管 catch
22、tube 倒空，换一个新的管。 14）不加任何液体， 14000 g 离心 1 分钟，再重复 1 次，以便将填料中剩余的溶液甩干。 将截留管 catch tube 倒空，更换管子。 15）将 SPIN 滤膜放置在 空气中，室温干燥 5 分钟。 16）将附着颗粒（ SPIN 滤膜上）在 50 100ul 的 DES（除热源和核酸酶的超纯水）中温和重悬。 （注：为避免纯化的 DNA 过度稀释，请加入能起到重悬作用的最少量的 DES；材料与方法 6 如果在 55 热快或水浴中孵育 5 分钟，可能 DNA 的产量会更高） 17） 14000 g 离心 1 分钟，将洗脱的 DNA 转移到干净的截留管 c
23、atch tube 中，将 SPIN 滤膜丢弃， DNA 可以用于 PCR 或其他下游实验使用， 20 长期保存 。 提取完成后， 以 DL2000 DNA marker 作为标准的分子量标记，通过琼脂糖凝胶（ 1.0%）电泳检测所提取的沉积物基因组总 DNA。 1.2.2 16S rDNA 基因的 PCR 扩增 古菌文库 16S rDNA 的 PCR 扩增采用古菌 16S rDNA 扩增通用引物： Arch21F ：5-TTCYGGTTGATCCYGCCRGA-3； Arch958R： 5- YCCGGCGTTGAMTCCAATT -3（该引物对退火温度 56.7 6，上海生工生物工程公司）
24、进行。 PCR 扩增反应体系如下： 模板 DNA 1.0l Arch958r(10M) 1.0l Arch21f(10M) 1.0l 10PCR Buffer(Mg2+ free) 2.5l dNTP(各 2.5mM) 2.0l Mg2+(25mM) 2.5l TaKaRa Taq(5U/l) 0.5l 用双蒸水（ ddH2O）补足 25l； 利用梯度 PCP 扩增古菌（一式四管），反应条件为 95 变性 30s， 5560 复性 30s，72 延伸 60s，如此反应进行 35 个循环，然后在 72 再延伸 10min，最后 4 保存。反应完成后 PCR 产物通过 1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳
25、检验，以 DL2000 DNA marker作为标准的分子量标记。 1.2.3 PCR 产物的纯化 经 PCR 反应获得的 DNA 溶液用琼脂糖凝胶回收试剂盒（天根，北京）进行纯化，用 1.2%的琼脂糖凝胶，操作按照试剂盒说明进行： 柱平衡：向吸附柱 CA2（吸附柱放入收集管中）中，加入 500L平衡液 BL，12000rpm离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 将单一的目的 DNA 条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分），放入干净的离心管中，称取重量。 向胶中加入 3 倍体积（ 0.1g 视为 100l）溶胶液 PN， 50 水浴放置约 10min，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。 将上步所得溶液加入吸附柱 CA2 中，室温放置 2min， 12000rpm 离心 1min。倒去收集管中的废液，将吸附柱 CA2 放入收集管中。
