1、 本科毕业论文 （ 20 届） 东海陆架沉积物可培养细菌的筛选和抑菌活性研究 所在学院 专业班级 生物科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 本科毕业论文 目录 目录 摘要 . 错误 !未定义书签。 Abstract . 错误 !未定义书签。 引言 . 1 1 材料与方法 . 2 1.1 样品来源 . 2 1.2 样品预处理方法 . 2 1.3 菌种分离 : . 2 1.3.1 海洋放线菌的分离培养 . 2 1.3.2 海洋细菌的分离培养 . 3 1.3.3 微生物平板菌落计数 . 3 1.3.4 菌株纯化 . 4 1.4 抑菌活性检测 . 5 1.4.1 实验原理 . 5 1
2、.4.2 实验方法 . 5 1.4.3 实验步骤 . 5 2 实验结果与分析 . 7 2.1 不同培养基的分离结果比较及菌落形态 . 7 2.2 计数结果： . 9 2.3 海洋微生物抗菌活性的分析 . 13 2.4 抑菌活性 : . 14 3 讨论 . 17 3.1 有关海洋细菌的分离培养方法 . 17 3.2 不同培养基的培养效果 . 17 3.3 琼脂扩散法 . 18 3.4 抑菌活性的情况 . 18 小结 . 20 参考文献 . 21 附译文 . 错误 !未定义书签。 致谢 . 错误 !未定义书签。 本科毕业论文 中文摘要 I 摘要 摘要 细菌是迄今最重要和具有药用价值的微生物种群。本
3、文从东海海 底 13 位点的4 个不同深度的海底沉积物中采用 6 种培养基并以不同浓度进行分离筛选 ,分离到 244 株微生物，其中 MR2A 培养基分离到 97 株，蛋白胨琼脂培养基分离到 57 株， AMM 培养基分离到 22 株， Zobell 培养基分离到 36 株，高氏一号培养基分离到 12 株，纯海水培养基分离到 20 株 ,采用琼脂扩散法对其中的 32 株菌株进行抑菌活性实验，以 大肠杆菌，枯草杆菌，白色念珠菌为指示菌 。结果表明：采用蛋白胨培养基和 Zobell 培养基来分的培养效果比较好，出菌率高。对 32 株菌株的抑菌活性实验中， 16 株具有抗菌活性，占总菌数的 50%。
4、 有 3 株菌株的抑菌活性很强（上 13 006、下 13 003、上 13012），占总数的 9.38%。同时对大肠杆菌和枯草杆菌有抑制作用的只有 1 株（上 13012），对白色念珠菌有强抑菌的只有 1 株（上 13 006） 。 并对有抑菌的菌株进行测序。 关键词 海底沉积物；细菌；抑菌活性；筛选 本科毕业论文 英文摘要 II Abstract Abstract:Bacteria are by far the most important and medicinal microbial populations. From the point of the East China Sea s
5、eabed 13 4 different depths in marine sediments with 6 medium and isolated at different concentrations, isolated 244 microorganisms, including 97 strains isolated MR2A medium, peptone agar medium separation to 57, AMM 22 strains isolated from the culture medium, Zobell 36 strains isolated from the c
6、ulture medium, Gao No. 12 strains isolated from the medium, the medium of pure water to the 20 strains isolated by agar diffusion method 32 strains of which the antibacterial activity tests, E. coli, Bacillus subtilis, Candida albicans as indicator bacteria. The results showed that: The peptone medi
7、um and Zobell medium for the cultivation of sub-results were better, the strain rate. 32 strains of antimicrobial activity tests, the 16 strains with antibacterial activity, 50% of total bacteria. 3 strong antibacterial activity strains (on 13 006, under 13 003, with 13 012), accounting for 9.38%. A
8、t the same time inhibit the E. coli and Bacillus subtilis, only one (on 13 012), inhibition of Candida albicans has only one strong (on 13 006). And has antibacterial strains were sequenced. Key words :Marine sediment ； bacteria ； Antibacterial activity； isolation 本科毕业论文 引言 1 引言 海洋微生物处于低温、高压、寡营养的特殊环
9、境 ,生物多样性远远超过陆地生物 ,其许多重要次级代谢产物是陆地生物所没有的 ,因此 ,是寻 找和发现新药活性先导化合物的重要资源 1.2 。海洋微生物中细菌具有很强的再生、防御和识别能力 ,海洋环境下的进化过程造就了其独特的代谢方式 ,从而产生大量结构新颖的代谢产物 ,以适应周围极端的生存环境 3 。据不完全统计 ,近年来 50%以上新发现的海洋微生物活性物质是由海洋放线菌这个庞大的分类群产生的 ,所以海洋细菌具有开发应用的巨大潜力。我国地处太平洋西部 ,大陆海岸线长达 1800 公里 ， 渤、黄、东、南四个海区面积 473 万平方公里 ,属我国管辖的海域约 300 万平方公里 ,有大小岛屿
10、 6000 多个 ,有着丰富的海洋 微生物资源。细菌作为抗生素、维生素、酶及酶抑制剂的丰富产生菌具有重大的经济意义。如何有效地分离细菌在根本上决定了能否充分地利用细菌资源。在细菌的分离工作中，目标菌细菌能否快速良好地生长涉及到许多问题，如样品处理、培养基选择，如何抑制杂菌及真菌的污染等。对此本课题研究从海底沉积物中大量筛选细菌并对其中的 32 株菌株进行抑菌活性的研究，以此来研究和开发新型的活性物质 。本科毕业论文 材料与方法 2 1 材料与方法 1.1 样品来源 样品采自东海海底沉积物的时间： 2007 年 4 月 25 日下午 2点。采用多管采样器采集 13 号站点的表层沉积物柱状样品（
11、0-10cm） ，根据层次不同依次编号：编号：131， 132， 133， 134（取样深度分别为水 -沉积物界面以下 03cm， 35cm， 58cm，810cm） ，船上 -20 冰箱保存，回实验室后进行样品分装，将样品分装为 5ml（ 2 管）和 10ml（ 1管）冻存管，等，然后在 -72超低温冰箱中保存，以备后续实验使用 。 1.2 样品预处理方法 4 采用物理的方法处理：采用取 1g 样品放在 120 、 1hour 烘干，称取 1g，加入99ml 灭菌陈海水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，摇床振摇约 30min(28 ,160r/s)，系列稀释。 1.3 菌 种分离 : 1.3.1 海
12、洋放线菌的分离培养 7： 预处理： 将样品放在 120烘箱，时间 1h,然后称取 1g，加入盛有 99ml 灭菌陈海水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，摇床振荡 30min（ 28 ， 160r/s） ，使样品与水充分混合。 稀释：用一支 1ml无菌吸管从中吸取 1ml悬浮液加入 9ml无菌海水的试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取 1ml加入另一盛有 9ml无菌海水的试管中，以此类推制成 10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释度的溶液（注意无菌操作）。 涂布：在蛋白胨琼脂培养基的九个平板底面分别用记 号笔写上 10-4,10-5,10-6 三种稀释度（每种稀释度做
13、三个平行组用于计数平均），然后用无菌吸管分别由 10-4,10-5,10-6三管样品稀释液中各取 0.1ml对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌涂布棒在培养皿表面轻轻涂布均匀，室温下静置 10min。平板倒置 25培养 3 7天。（也可用已灭菌的移液枪和一次性枪头来操作） ( )蛋白胨琼脂培养基： 本科毕业论文 材料与方法 3 葡萄糖 10g， 蛋白胨 2g， 酵母膏 1g， 琼脂 15 20g，陈海水 1000ml, pH 7.5， 115 灭菌 25min； 灭菌后添加 0.005%重铬酸钾抑制剂， 10滴 /250ml。 ( )高氏一号培养基 (GAU)：可溶性淀粉 20g, KN03
14、1g, K2HP04 0.5g, MgS04.7H20 0.5g, FeS04.7H20 0.01g，琼脂 15 20g，陈海水 1000mL, pH 7.2 7.4 配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至 1000ml， 121灭菌 20min。 ( )AMM 培养基：琼脂 18g ，可溶性淀粉 10g，酵母浸膏 4g，蛋白胨 2g，陈海水 1000ml， pH自然。 1.3.2 海洋细菌的分离培养 ： 预处理：称取研碎的样品各 10g，加入盛有 90ml 灭菌陈海水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，摇床振荡 30min（ 28 ，
15、 140r/s） ，使样品与水充分混合。 稀释：用一支 1ml无菌吸管从中吸取 1ml悬浮液加入 9ml无菌海水的试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取 1ml加入另一盛有 9ml无菌海水的试管中，以此类推制成 10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释度的溶液（注意无菌操作）。 涂布：在下列两种培养基（ Zobell 2216E 培养基和 MR2A 培养基）的各九个平板底面分别用记号笔写上 10-4,10-5,10-6 三种稀释度（每种稀释度做三个平行组用于计数平均），然后用无菌吸管分别由 10-4,10-5,10-6三管样品稀释液中各取 0.1ml 对号放入已
16、写好稀释度的平板中，用无菌涂布棒在培养皿表面轻轻涂布均匀，室温下静置 10min。平板倒置 25培养 24 48h。 ( )Zobell 2216E培养基：蛋白胨 5g，酵母浸膏 1g，磷酸铁 0.01g， 琼脂 15 20g， 蒸馏水 250 ml, 陈海水 750 ml, pH 7.2， 121 灭菌 20min； ( )MR2A(Difco)培养基 : (proteose peptone朊蛋白胨 0.5 g, 酵母浸膏 0.5 g, 酪蛋白氨基酸（水解酪蛋白） 0.5 g, 葡萄糖 0.5 g, 可溶性淀粉 0.5 g, 丙酮酸钠 0.3 g, K2HPO4 0.3 g, MgSO47H
17、2O 0.05 g, 琼脂 15 g, 蒸馏水 500 ml, 陈海水 500 ml, pH 7.2)。 以上培养基做 2份，一份原始配方，一份除琼脂外，其他的药品都稀释 10 倍；并以只用陈海水和琼脂做对照 。 1.3.3 微生物平板菌落 计数 7 细菌在培养 10-20 天后可以进行菌落计数，一般选择每个平板上长有 30 300 个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量比较合适。 每毫升中菌落形成单位（ cfu） =同一稀释度三次重复的平均菌落数 x稀释度 x100 本科毕业论文 材料与方法 4 1.3.4 菌株纯化 6 一、 将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述几种培养基的斜面上（注
18、意在挑取的菌落部位用记号笔划个小圆圈做记号，避免重复挑取），分别置于 25和 30 温室培养，待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色（革兰氏染色法）后用显微镜检查是否为单一的微生物，若发现有杂菌， 需再一次进行分离纯化，直到获得纯培养。 二、采用划线法纯化 7，即用接种环挑取一环菌体在平板的一边，作第一次平行划线 2-3 条，转动培养皿约 70。用在火上烧过并冷却的接种环，通过第一次划线部分，作第二次平行划线。用同样的方法通过第二次平行划线部分，作第三次平行划线。划线完毕后将平板倒置于 25和 30恒温箱中培养。大约培养 2 5 天，即刚刚长成小菌落时挑取单菌落进行反复纯化。 三
19、、根据平板上放线菌的鉴别依据对平板的菌落进行鉴别 8。将初步确认的单个放线菌菌落挑取划线接种于高氏一号培养基平板上， 25纯化培 养 3 5 天。此时，初步认为放线菌已 分 离纯化，挑入高氏一号斜面培养基中，短期保藏供后续实验用。 平板上放线菌的鉴别依据 9： (1)菌落有核，以核为中心，向四周呈放射状分布。特别是菌落表面如确认有菌丝时，至少可与细菌容易区别。 (2)菌落表面褶皱。 (3)当与细菌难以区分时，用细棒轻戳菌落，如是细菌菌落则可被戳破，如是放线菌，由于菌丝纠缠在一起，菌丝极不易被戳破。 (4)淡粉红色的菌落（有时也呈浓粉红色）中央有略微黑色突起者为小单孢菌的菌落，有时表面呈类似细菌
20、的湿润状态，整个菌落被黑色孢子覆盖。 四、菌种保 存（液体石蜡法） 10 1. 用速冻保藏法 (俞俊棠等， 2003)：吸取 500 ul 的菌悬液 (浓度为 108-1010个/ml)同 500ul, 40%灭菌甘油混匀后，置 -20 或 -60 保藏。 2. 甘油法 (短期保存 )：在菌株在斜面培养基上处于最佳生长状态时，加无菌甘油覆盖，封口后，保存于 4 。此法保存的菌株 1-3个月活化一次。 本实验室分离的海洋菌株的命名方法 :采样地区 (用数字 13 表示 )+分离培养基编号(I、 II 或 III 等 ) +样品序号 (可以是一个或多个数字 )+从该样品中分离到的菌株序号(最后两个
21、数字 )，例如：上 13 001 ，上表示原始配方的培养基，“ 13”表示采样地区 13 位点 ,“ ”表示分离培养基的种类， “001”表示从样品中分离的菌株标号。下本科毕业论文 材料与方法 5 13 001，“下”表示稀释 10 倍的培养基，其余标记同上。 1.4 抑菌活性检测： 1.4.1 实验方法： 采用滤纸法和琼脂扩散法进行抑菌活性检测 滤纸法：将浸湿的有待测菌的发酵液的滤纸帖在含有指示菌的平板上。经培养后根据抑菌圈有无及其大小初步判断抗菌能力。 琼脂扩散法：将在已接种生长期的指示菌的平板上打孔 孔内注入定量待测菌菌液或发酵液，经过培养后观察抑菌现象。 1.4.2 实验材料： 本文采
22、用的指示菌是 大肠杆菌（ Escherichia coli），枯草杆菌（ Bacillus subtilis），白色念珠菌（ Candida albicans）用的方法是琼脂扩散法。采用的培养基是 马铃薯蔗糖琼脂培养基。用 LB 培养基活化菌株。 1.4.3 实验步骤： 马铃薯蔗糖琼脂培养基 (PDA)：马铃薯 200g，琼脂 25g， 蔗糖 20g， 陈海水1000ml。将马铃薯削皮，切成小块，放在水中（马铃薯：水 1： 5）煮沸 30min，然后用纱布过滤，加入 20g蔗糖。将琼脂称出，放入烧杯中加水煮沸，全部溶化后，同混合，加陈海水补足至 1000ml,121灭菌 30min。 活化菌株
23、：将 大肠杆菌 Escherichia coli，枯草杆菌 Bacillus subtilis，白色念珠菌Candida albicans 从保种的试管里取出接种于装有液体 LB 培养基的锥形瓶内活化。（ 28 190r/min ） 制备发酵液：发酵培养基 LB 液体培养基，将保存的菌株接种于 LB 锥形瓶中（每种菌株各 2 份。），震荡培养（ 25 190rmin） 3-7 天 ，取发酵培养基离心（ 4000rmin 15min） ，得上清液即发酵液，备用。其中一份不离心，做菌液。 指示菌 平板的制作：指示菌活化培养取 0.1ml 指示菌涂布到无菌平板 45 的指示菌培养基（ PDA 固体培养基做白色念珠菌的平板， PDA 做大肠杆菌和枯草杆菌的平板）混匀，室温冷却，用 75%酒精灭菌过的直径 1mm 的一次性吸管打孔。每个平板打 6 个孔， 3个为发酵液 3 个为菌液 并在培养皿底部做上标记。 加样：用移液枪将发酵液和菌液加样到各自的孔内。大约加 40ul，于 25 培养（不倒置） 本科毕业论文 材料与方法 6 以测量的抑菌圈 (直径 )大小来判断拮抗反应的强弱 11。注：抑菌圈 18mm 为 “ ”。 “ ”表示有抑菌活性； “ ”表示抑菌活性较强； “ ”表示抑菌活性很强； “-”表示无明显抑菌活性。
