1、 本科毕业论文 （ 20 届） 石油烃降解菌的筛选 所在学院 专业班级 食品科学与工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 1 目录 摘要 1 ABSTRACT2 1 前言 3 1.1 土壤石油污染的来源 3 1.2 石油污染物对土壤的危害 3 1.3 石油污染物的修复 4 1.4 微生物降解石油烃的研究 4 2 实验材料、主要仪器与试剂 5 2.1 实验材料 5 2.2 主要仪器 5 2.3 主要试剂 5 2.4 培养基 6 3 实验方法 6 3.1 菌种的富集培养 6 3.2 菌种的筛选 6 3.3 菌种的生理生化鉴定 6 3.4 分析方法 6 4 实验结果与讨论 7 4.1
2、 筛选结果 7 4.2 菌株 XL-3 的鉴定 8 4.3 菌株 XL-3 培养条件的优化 9 5 小结 11 参考文献 11 致 谢 错误 !未定义书签。 1 摘要 伴随着 现代石油工业的快速发展，石油污染的问题 也逐渐严重，这意味着，如何正确地解决石油污染的问题也日趋重要。在治理石油污染的各 种 方法里，微生物降解是最有效的 而 且对环境的危害也 是 最小的。所以本文就从 被石油污染的 土壤中筛选石油烃降解菌 ,通过 分离和培养 了其中三 株 生长较稳定的石油烃降解菌， 然后， 采用紫外线分光光度 计 测定这三种降解菌的降解率，取降解率最高的降解菌做进一步的研究，经过生理生化的鉴定，这种高
3、效率的石油烃降解菌降解菌属于 假单胞菌属，通过 pH值和温度等单因素的优化，确定降解菌的最优温度为 35 ，最适 pH值为 5.0， 并在接种量为 5%时，降解率达到最高值 70%。 关键词 石油烃；降解菌； 筛 选 2 Abstract With the rapid development of the modern Oil Industry, the problem of oil pollution is also increasing, so how to solve becomes important. Among the ways of different solutions, th
4、e microbial degradation is the most effective, which is also the least harmful to environment. So this article is arming on isolation of the ordinary petroleum hydrocarbon degrading bacteria and understanding the basic nature of them and finding the best conditions of their living environment. It wa
5、s found that a common kind of petroleum hydrocarbon degrading bacteria which are Pseudomonas. The degradation rate is between 60% and 70%. And the most suitable temperature and pH are 35 and 5.0.When the inoculation is 5%, the bacterial will reach the highest isolation rate. Key words Petroleum hydr
6、ocarbons; Degrading bacteria; Microbiology； Isolation 3 1 前言 1.1 土壤石油污染的来源 石油污染 泛指原油和石油初加工产品 (包括汽油、煤油、柴油、重油、润滑油等 )及各类石油的分解产物所引起的污染。在石油的开采、贮运、炼制加工以及使用过程中，不可避免的会造成石油的溢出和排放，对环境（大气、土壤 、地表及地下水）产生极大影响。土壤作为物质循环及能量交换的重要场所，常常是污染物在环境中迁移、 滞留和沉积的最终承受者。石油污染物主要通过以下三种途径进入到 土壤： 原油 泄漏和溢油事故引起落地原油污染； 含油矿渣、污泥和垃圾的堆置，致使石
7、油向土壤渗漏并向周 围扩散； 含油 污水灌溉农田1。这三个因素造成 的 污染面积大、污染物含量高，都是引起土壤石油污染最主要的因素。 同时，对石油开采等过程中产生的含油污泥处理不恰当也是另一个主要的因素。在原油的脱水过程中，脱水罐、污水罐等底部积累了大量含油的污泥；在炼油厂的污水处 理场（像隔油池底、曝气池等）也存在着大量的含油污泥。而使用含油污水灌溉农田是产生土壤石油污染的另一重要因素。据不完全的统计，由于普遍使用污水的灌溉，导致土壤污染的面积已经达到了 9300公顷。 现在世界石油总产量每年在近 3l010t左右，我国当前石油年产量也早己超过 1108t，而每年新污染的土壤也达 1105t
8、之多 2。 1.2 石油污染物对土壤的危害 由于石油污染物难以消除，当大量的石油污染物进入环境，不仅破坏生态平衡，制约了经济的发展，而且影响到人类的健康和生 存 3，其主要影响表现在以下三方面 ： 1、对土壤理化性质的影响 石油类污染物进入土壤后，由于密度小和 具有 疏水性，容易在土壤中与土粒粘结，影响土壤的透气性； 其次， 石油中含有大量的有机碳，会改变土壤的结构，使碳、氮、磷比例严重失衡； 再次 ，由于石油还会限制营养元素，不能使其从土壤颗粒进入到土壤溶液中，导致土壤肥力的下降。而植物的根系通常在土壤表层比较发达，所以石油对土壤的污染可直接阻碍植物根系的呼吸与营养的吸收，可引起根系腐烂，进
9、而影响到植物的生长 4。 2、对土壤微生物群落的影响 微生物是土壤生态系统中的重要成分，在土壤的物质流动和能量转移中起到 重要作用。许多研究者表明，许多石油的成分，对很多微生物 有毒害作用 ，因此当污染物进入土壤环境后，会破坏土壤微生物群落的结构和改变群落的多样性。 3、对人类和动物的影响 通常，石油污染物可通过皮肤接触、呼吸等途径，进入到动物和人体内，降低器官的正常功能，会引发多种的疾病。而且，石油对动物的多种器官也会有损伤，在石油的各个组分中，石油中的芳香烃对生物的毒性最严重，尤其是多环芳烃的毒性。许多研究都表明，一些石油烃类进入动物体内后，对哺乳类动物及人类有致癌、致畸和致突变的作用 5
10、。 总之，由于石油特殊的物理化学性质 ，残留时间长，使土壤中的碳源大量增加，直接导4 致土壤中 C:N 比失调以及酸碱度的变化，破坏了土壤结构，给受污染土壤带来一系列的危害，对污染地区的生态、作物以及人类健康造成诸多负面影响 6。 1.3 石油污染物的修复 虽然 土壤对石 油的污染具有一定的自净能力，能通过本身的一些物理和化学变化，来消除石油污染的副作用。但是当进入环境的石油污染物超过了土壤自净的能力时，这种自净作用就不能负荷了。所以，经过人们的不断研究，慢慢出现了以物理法、化学法和生物修复法等的人工修复石油烃污染的方式。但是物理、化学修复法虽然可以产生 一定的处理效果，但都存在明显的缺陷 ：
11、 处理成本较高、处理不彻底以及易产生严重的二次污 染问题 7。 石油 污染物的生物修复法，是指利用特殊的生物进行吸收、转变、消除或降解石油污染物的污染，使环境慢慢净化。它最根本的出发点是 使 石油烃作为反应物参与了微生物的生化反应 ,微生物通过代谢作用降解土壤中的污染物 8。所以生物修复技术具有费用廉价、处理的效果好、对环境的副作用小、没有二次污染、也不破坏植物生存所要的土壤环境等突出的优点。 1.4 微生物降解石油烃的研究 1.4.1 降解石油微生物的种类 目前为止 ， 能降解石油 中各种烃类的微生物共有 100余属、 200多种 。分别属于细菌、放线菌、霉菌及酵母菌等，其中细菌约占 40个
12、属，在海洋生态系统中占主导地位 9。其中，原核微生物主要有假单孢菌属、芽抱杆菌属、无色杆菌属等；真菌主要是假丝酵母属、红酵母属、青霉属、木霉属等；此外，藻类也是降解石油污染物的微生物群落的一种，如鱼腥藻属、鞘藻属、念珠藻属等。 但一般情况下，降解微生物只占总微生物群落全部的 1%， 即使在 石油污染物存在时，降解者的比例 也只 会增加到 10%10。 并且 在许多环境下，降解菌的降解率不高，所以筛选高效的石油降解菌的 研究受到人们普遍的关注。 1.4.2 微生物降解的机理 微生物降解石油烃的过程主要分三步来进行 :首先是石油烃在水中的溶解力跟在微生物表面的吸附 ;其次是石油烃在微生物细胞膜内的
13、跨膜运输 ;最后是石油烃进入细胞膜内与降解酶结合时发生的酶促反应 11。具体如下： 第一 ，石油烃在微生物表面的吸附。由于石油烃是属于疏水性化合物，大部分的石油烃仍会吸附在土壤颗粒上，不容易直接被微生物所利用，则限制了微生物对石油烃降解的能力。然而，微生物却能调节自身的适应机制来提高对石油烃的利用率。目前有两种解释：一种是特异性附着机制， 另一种是是烃类乳化机制 12。 第二，石油 烃的跨膜运输。这个过程是石油烃降解菌的重要环节。但是由于对这个跨膜运输的机理尚未清楚，目前的理论存在被动运输和主动运输两种理论 13。 例如， 有人认为萘是通过被动运输的方法进入到微生物体内的，并不存在转运蛋白。相
14、反，另外一些人则5 认为微生物在吸收萘的过程中有存在主动运输。甚至也有部分研究表明，由微生物产生的生物表面的活性剂能使其细胞膜的结构发生改变，从而增加污染物通过细胞膜的概率 14。 第三，石油烃在微生物内的降解机理。一般情况下， C1C3的气态成分甲烷、乙烷 和丙烷，只能被极少数的微生物利用；而碳原子数大于 4的化合物，其分子量越小越容易被微生物 降解；而当 碳原子数相同时，饱和烃比不饱和烃更容易被降解，直链比支链化合物更易被降解 1518。 2 实验材料、主要仪器与试剂 2.1 实验材料 土样：取温州、宁波、山东、丽水和绍兴等地适量的土壤。 2.2 主要仪器 仪器名称 型号 厂家 高压灭菌锅
15、 DYM-YK20L 北京勤诚盛达科学仪器有限 公司 电子分析天平 7G328B 上海天平仪器厂 高速离心机 TGL-16C 上海安亭科学仪器厂 恒温干燥箱 202-0(AS) 北京勤诚盛达科学仪器有限公司 生化培养箱 SPX 宁波江南仪器厂制造 紫外分光光度计 UV-9100 北京瑞利仪器分析公司 电热恒温水浴锅 HHS 上海博讯实业有限公司医疗设备厂 恒温振荡器 HZQ-C 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 pH计 PD-20 北京赛多利斯天平有限公司 超净工作台 W-CJ-IF 苏净集团安泰公 司 2.3 主要试剂 试剂 纯度 产地 牛肉膏 生化试剂 北京奥博星生物技术责任有限公司 大豆
16、蛋白胨 生化试剂 北京奥博星生物技术责任有限公司 革兰氏染液 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 甲基红试剂 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 微量元素溶液 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 V-P试剂 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 吲哚试剂 分析纯 上海劲马生物科技有限公司 中性红指示剂 分析纯 上海化学试剂采购供应站 TE缓冲液 分析纯 上海化学试剂采购供应站 碘液 分析纯 上海化学试剂采购供应站 石油醚 分析纯 上海化学试剂采购供应站 6 2.4 培养基 2.4.1 富集培养基（ g/L） 石油 2.5，蛋白胨 5， NaCl 5和 H2O（ pH7.0），以石油烃为唯一 碳源 2.4
17、.3 筛选培养基（ g/L） (NH4)2SO4 1.5， CaCl2 0.02， NaNO31.5， K2HPO41， KCl 0.5， MgSO47H2O 0.5， FeSO47H2O 0.01， 调节至 pH8.0后，在 121 下 20min灭菌，冷却后加入 2.5g石油 ， 最后加 1.2%的琼脂制造成相应固体培养基。 2.4.4 无机盐培养基（ g/L） (NH4)2SO4 1， KH2PO4 1， Na2HPO4 1， CaCl2 0.1， NaCl2， MgSO4 0.2， FeSO47H2O 0.01（ pH 7.0） 2.4.5 平板培养基 在上述的无机盐培养基中加入 20
18、g/L的琼脂 3 实验方法 3.1 菌种的富集培养 用移液管移取样品，加入到 100mL 的富集含油培养基中，在 37 ,140r/min 的摇床振荡培养 7d。等培养液充分混合后，吸取 5mL 的培养液，转移到别的新鲜的富集含油培养基中。重复实验 3 次。 3.2 菌种的筛选 3.2.1 初筛 将接种后的液体油培养液梯度进行稀释，吸取 0.3ml 的菌液均匀涂布到固体筛选培养基平板上，并且在 35 下恒温培养到长出菌落为止。观察不同的菌株在固体培养基中生长状态，并筛选出个 别生长较快、稳定并且基本特征一样的菌落。 3.2.2 复筛 将筛选出来的菌株再次培养到固体培养基平板上，在初筛的条件下，
19、同样培养直至长出菌落为止。接着选取特征基本相同的单菌落到固体筛选培养基上并多次划线分离，数次培养后，就会得到比较纯化的单菌落。选择三种不同形态和颜色的单菌落到不同的斜面保存培养基中，最后保存到冰箱里。 3.2.3 菌种的确定 由于本课题要筛选的是对石油烃降解能力较高的降解菌，所以 选择三种生长稳定且形态特征一致的菌种。 3.3 菌种的生理生化鉴定 根据分离菌的菌落和菌体形态，芽孢的有无和着生 情况，革兰氏染色以及生理生化反应，按东秀珠常见细菌系统鉴定手册进行接触酶反应、好氧性试验、淀粉水解、硝酸盐还原、明胶液化、糖醇类发酵耐盐性试验等生理生化试 验 18。 3.4 分析方法 3.3.1 标准曲
20、线的制定 将菌种转移到液体培养基中，接到液量为 100ml的三角瓶装里，然后将三角瓶放在 30 ，150rpm的摇床培养 2小时后，取出菌液。在分光光度仪波长 254nm处测定培养液的 OD值，与未接菌种的液体培养基做空白对照。每隔六小时测定 OD值。以标准油浓度为横坐标，测得的吸光度为纵坐标，绘制其标准曲线。 7 3.3.2 石油降解率的测定 同样，将不同浓度的菌种转移到液体培养基中，接到液量为 100ml 的三角瓶装里，然后将三角瓶放在 35 ， 150rpm 的摇床培养 2 小时后，取出菌液。在 254nm 处，将各种菌种的稀释液在紫外可见分光光度计下测得 OD 值，通过标准曲线，测定培
21、养液残余石油烃的浓度 ,并计算石油烃降解菌的降解率。采用以下的计算公式 : 降解率 (%)=（ C1-C2） /C1100% 式中 :C1为石油的初始浓度 mg/ml， C2为石油的测定浓度 mg/ml 3.3.3 生长量的测定 细菌生长量的变化，采用菌悬液 OD600间 接反映。先取 8mL的培养液放入离心管中，在5000r/min的转速下离心 10min，取上清液收集菌体，并用无菌水洗涤三次，将收集到的湿菌体接入到无菌水中，形成均匀稳定的菌悬液后，定容到 8mL，以无菌水为参照，在紫外分光光度计 600nm处测定吸光度。 3.3.4 生长曲线的制定 取 XL-3菌株接种在含有 150mL富
22、集培养基的锥形瓶中，在 30 、 150r/min的摇瓶中培养。在 20h内，每隔 2h后取样品； 20h之后，每隔 4h后取样品，连续取到 52h。每次取必须用无菌的移液管取 8mL置于不同的离心管中标号，放在冰 箱中冷藏。以未接菌种的富集培养液在600nm处测的 OD值为对比，控制其吸收值在 00.9之间，若浓度过高，必须稀释。以培养时间为横坐标， OD值为纵坐标作图，采用比浊法测定细菌的生长曲线。 4 实验结果与讨论 4.1筛选结果 将筛选出来的三种菌种分别记为 XL-1,XL-2,XL-3。 在 254nm 处，以石油作为空白，依次测定好标准油样品的吸光度值，绘制了标准曲线并得到回归方
23、程。如图所示： y = 0.0092x + 0.0242R2= 0.999100.10.20.30.40.50.60 10 20 30 40 50 60石油浓度(mg/L)OD值8 图 1 石油浓度 吸光度曲线 根据标准曲线测得的降解率，如表 1 所示： 表 1 三种菌种的降解率 编号 降解率 XL-1 20.3% XL-2 38.5% XL-3 61.4% 因为 XL-3 的降解率最高，所以以 XL-3 为菌株，作进一步的鉴定和降解条件的研究。 4.2 菌株 XL-3的鉴定 4.2.1 个体形态的特征 在 电 镜下，菌株 XL-3 为革兰氏阴性短杆菌，生鞭毛，不产生芽孢， 大小为(0.50.8)m(0.81.2)m， 如图 2 所示。 图 2 XL-3菌株电镜图 4.2.2 菌落的特征 该菌落呈半透明、圆形、白色、光滑湿润、形态饱满。且菌落直径约 0.16mm 0.2mm。 4.2.3 生理生化特征 根据常见细菌系统鉴定手册与伯杰氏手册，鉴定了菌株 XL-3 的生理生化特征，结果如下表所示。
