1、本科毕业论文系列开题报告生物工程鲈鱼MPEPCK表达载体的构建一、选题的背景与意义鲈鱼LATEOLABRAXJAPONICUS，也叫海鲈、花鲈、七星鲈，属于鲈形目，是一种广盐性的食肉食性鱼类，为常见的经济鱼类之一，也是发展海水养殖的品种，具有很高的经济价值。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PHOSPHOENOLPYRUVATECARBOXYKINASE，PEPCK，EC41132催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸，是糖异生途径的第1个限速酶。PEPCK按照其在细胞内的定位不同分为2个亚型，即胞浆型PEPCK和线粒体型PEPCK分别用CPEPCK和MPEPCK表示，它们有类似的动力学性能和大致相同的分子量，
2、但编码的基因不同。CPEPCK是糖异生途径的重要限速酶，也是调节脂肪异生途径的关键酶。MPEPCK属于构成性表达，不受营养状态和激素的调节。目前对该基因的研究资料仅见于少数几种鱼，已分离克隆PEPCK基因CDNA全序列或部分序列的鱼有如下几种虹鳟ONCORHYNCHUSMYKISS、黑鲷ACANTHOPAGRUSSCHLEGELI、斑马鱼DANIORERIO、翘嘴红鲌ERYTHROCULTERILISHAEFORMIS、大西洋鲑SALMONSALAR、金头鲷SPARUSAURATA和鲤鱼CYPRINUSCARPIO等。PEPCK作为糖代谢中重要的限速酶，在鱼类利用碳水化合物的过程中起了重要的作
3、用，相反这些酶的活性和表达也受到饲料中碳水化合物水平的影响。就目前国内外对一些鱼类的研究可知，碳水化合物对鱼类PEPCK的影响还没有统一定论。总之，对鱼类糖代谢酶的研究是比较复杂的，不同食性的鱼类以及同种鱼类不同的生长阶段、生长环境等都对其有不同的影响。本研究从鲈鱼肝脏中分离克隆了PEPCK基因的CDNA序列，并将目的基因导入质粒中构建其表达载体，为今后的进一步研究PEPCK基因在糖代谢和脂代谢过程中的功能奠定了基础。本研究也可提供肉食性鱼类糖代谢特性的基础资料，可为今后人工养殖中饲料的选择提供依据，在水产养殖中具有一定的实际意义。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题本研究通过提取鲈鱼肝脏内的
4、总RNA，根据获得的鲈鱼PEPCK基因及相应的限制性酶切位点设计合成引物来获取目的基因，并将目的基因导入到质粒中观察其表达。拟解决的问题有鲈鱼肝脏内总RNA提取问题；PCR扩增的最适条件以及如何根据获得的鲈鱼PEPCK基因及相应的限制性酶切位点设计合成引物。三、研究的方法与技术路线1、鲈鱼肝脏总RNA的提取使用TRIZOL法提取鲈鱼肝脏总RNA，经过加TRIZOL、组织匀浆、氯仿与异戊醇抽提等步骤，将提取的总RNA溶于焦碳酸二乙酯处理的灭菌水中，琼脂糖凝胶检测RNA的完整性，80低温冰箱保存2、RTPCR合成CDNA并扩增编码基因通过RTPCR技术合成CDNA并扩增编码基因94下预变性4MIN
5、；PCR循环为94下变性30S，56下退火30S，72下延伸50S，总计34个循环；最后在72下延伸5MIN。3、目的基因的获取根据获得的鲈鱼PEPCK基因及相应的限制性酶切位点设计合成引物。并通过PCR扩增目的基因。PCR参数944MIN；9430S，5630S，7250S，循环30次；725MIN，扩增产物用1琼脂糖凝胶电泳进行分析，观察片段大小，并纯化PCR产物。4、表达载体的构建将纯化的PCR产物经双酶切后克隆进入同样经过双酶切的PET28A质粒中，获得重组质粒，转化为ECOLIDH5感受态，筛选阳性菌株，测序。四、研究的总体安排与进度2010年12月实验前准备1查询中英文资料、文献2
6、设计实验方案3准备实验中所需的材料2011年24月进行实验1提取总RNA2合成CDNA并获得PEPCK基因3目的基因的获取以及表达载体的构建2011年5月上旬撰写论文1实验结果的整理、分析2完成论文初稿并交指导老师修改2011年5月中旬准备答辩1完成论文正稿2准备毕业答辩五、主要参考文献1戈贤平,俞菊华,吴婷婷,等翘嘴红鲌PEPCK基因的克隆和序列分析J中国水产科学GEXIANPING,YUJUHUA,WUTINGTING,ETALMOLECULARCLONINGANDCHARACTERANALYSISOFCDNAOFPHOSPHOENOLPYRUVATECARBOXYKINASEPEPCKI
7、NERYTHROCULTERILISHAEFORMISJJFISHSCICHINA,2006,1333893962HANSONRW,RESHEFLREGULATIONOFPHOSPHOENOLPYRUVATECARBOXYKINASEGTPGENEEXPRESSIONJANNUREVBIOCHEM,1997,665816113MATTEA,TARILW,GOLDIE,H,ETALSTRUCTUREANDMECHANISMOFPHOSPHOENOLPYRUVATECARBOXYKINASEJJBIOLCHEM,1997,272810581084PANRATS,PLAGNESJUANEBREQUE
8、J,ETA1HEPATICPHOSPHORENOLPYMVATCARTRAXYKINASEGENEEXPRESSIONISNOTREPRESSEDBYDIETARYCARBOHYDRATESINRAINBOWTROUTOCORHYNCHUSMYKISSJJEXPBID2001,2043593655TRANULISMA,DREGNIO,CRISTOPHERSENBETA1AGLUCOKINASELIKEENZYMEINTHELIVEROFATLANTICSALMONSALMOSOLARJCOMPBIOCHEMPHYSIOL,1996,114B35396STRAUSBERGRL,FEINGOLDE
9、A,GROUSEIHETA1GENERATIONANDINITIALANALYSISOFMORETHAN15000FULLLENGTHHUMANANDMOUSECDNASEQUENCESJPINENATLACADSCIUSA,2002,992616899169037PANSERATS,PLAGNESJUANEKAUSHIKSGLUCONEOGENICENZYMEGENEEXPRESSIONISDECREASEDBYDIETARYCARBOHYDRATESINCOMMONCARPCYPRINUSCARPIOANDGILTHEADSEABREENZYMESPEPCK11引言磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶P
10、HOSPHOENOLPYRUVATECARBOXYKINASE,PEPCK,EC41132催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸，是糖异生途径的第1个限速酶。PEPCK按照其在细胞内的定位不同分为2个亚型，即胞浆型PEPCK和线粒体型PEPCK分别用CPEPCKMPEPCK表示，它们有类似的动力学性能和大致相同的分子量，但编码的基因不同1。这2种亚型的PEPCK在细胞内的分布多少因物种和器官而异。在人和鸡中，CPEPCK和MEPCK的比例基本相同，在兔和仓鼠中，PEPCK的活性主要是MPEPCK，但是在大鼠肝脏中，MEPCK的比例很少1。在哺乳动物，CPEPCK主要表达在肝、消化道、肾和脂肪组织，它
11、的转录受各种营养状态和病理状态的影响，如高蛋白食物、饥饿、甲状腺机能亢进和糖尿病等都影响其表达1。CPEPCK是不仅是糖异生途径的重要限速酶，也是调节脂肪异生途径也叫三酰甘油异生途径关键酶1,2。MPEPCK属于构成性表达，不受营养状态和激素的调节1。研究表明，在哺乳动物进食含大量糖类的饲料时，肝中PEPCK水平大幅度下降，禁食或饲以高蛋白低糖日粮时，则可使其水平提高，并且PEPCK活性的调节主要表现在转录水平。但由于鱼类对碳水化合物的利用率不高，因此对该基因的研究资料仅见于少数几种鱼，目前已分离克隆了虹鳟ONCORHYNCHUSMYKISS3、黑鲷ACANTHOPAGRUSSCHLEGELI
12、4、斑马鱼DANIORERIO5、翘嘴红鲌ERYTHROCULTERILISHAEFORMIS6、大西洋鲑SALMONSALAR7、金头鲷SPARUSAURATA和鲤鱼CYPRINUSCARPIO等8的PEPCKCDNA全序列或部分序列，并对其序列进行比较，研究该基因的组织表达特性以及在不同饲料配方情况下的表达3,8。另外，从对肉食性虹鳟、大西洋鲑和鲈鱼的研究结果发现，在这些肉食性鱼类中，该基因的表达与饲料中碳水化合物含量无关。鱼体内的葡萄糖是由非碳水化合物产生的，而体内持续内源性葡萄糖的生成使鲈鱼等肉食性鱼对饲料中碳水化合物利用率降低。对鲤鱼的研究显示，该酶在摄食后的6H和24H表达没变化，
13、投喂含碳水化合物饲料比不含碳水化合物饲料该基因的表达有所降低，但差异不显著。由于PEPCK不存在别构调控和翻译后修饰调控，因而对其转录水平的调节是对该酶活性调节的重要方式。对于哺乳动物的CPEPCK的研究发现，许多激素包括胰高血糖素、甲状腺素、糖皮质激素和视黄酸均可以提高它的表达，而胰岛素不仅可以抑制它的本底表达，还抑制由这些激素引起的表达9。另外，由于参与糖异生的另外2个调节酶6磷酸葡萄糖酶在虹鳟中也不受饲料中碳水化合物含量的影响10,11，1，6二磷酸果糖酶在大西洋鲑12，河鲈中也不受影响，推测可能与肉食性鱼类在自然界并不摄取碳水化合物有关13,14。鲈鱼LATEOLABRAXJAPONI
14、CUS俗称花鲈、七星鲈、鲈鲛等，属与鲈形目鮨科花鲈属。主要生活在中国、朝鲜及日本的沿海浅海河口，是一种广温、广盐的凶猛肉食性鱼类。随着大规模人工育苗的突破，鲈鱼已成为海水网箱养殖的重要经济鱼种之一，在浙、闽、粤三省得到大规模的养殖。鲈鱼不仅供应内销，还出口韩国等东南亚国家，是我省水产业创汇的产品。目前养殖鲈鱼群体出现了经济性的衰退现象，如生长缓慢、性成熟提早、肉质变差等，尤其是鱼体脂肪含量越来越高，这不仅影响鲈鱼的肉质和风味，而且大大降低了饲料转化率，严重影响到鲈鱼的产量、销售和商品价格，成为严重制约鲈鱼养殖业发展的因素15,16。本研究从鲈鱼肝脏中分离克隆了PEPCK基因的CDNA序列，并将
15、目的基因导入质粒中构建其表达载体，为今后的进一步研究PEPCK基因在糖代谢和脂代谢过程中的功能奠定了基础。本研究构建的表达载体也可用于作为研究肉食性鱼类糖代谢特性的基础材料，可为今后人工养殖中饲料的选择提供依据，在水产养殖中具有一定的实际意义。22MPEPCK表达载体的构建21实验材料和仪器211实验材料（1）实验用鲈鱼购买于宁波水产品大世界。（2）本实验室保存的大肠杆菌ESCHENICHIACOLIDH5。212实验中所用试剂盒（1）PRIMESCRIPTTM1STSTRANDCDNASYNTHESISKITTAKARA公司。（2）DNA凝胶回收试剂盒（碧云天生物有限公司）。（3）PMD18
16、T试剂盒（TAKARA公司）。（4）质粒抽提试剂盒（碧云天生物有限公司）。213其他主要试剂（1）LB培养基950ML蒸馏水中加入5G酵母提取物（OXOID公司），10G胰蛋白胨（OXOID公司），5GNACL。调整PH值至70定容至1000ML。如需要固体培养基则每1000ML液体培养基中加入15G琼脂，高压灭菌后备用。（2）01MOL/LCACL2称取分子量为147的CACL22H2O（上海生工生物工程技术服务有限公司）147G加蒸馏水定容至100ML，高压灭菌后4保存备用。（3）75乙醇取75ML的无水乙醇（杭州长征化工厂）加以DEPC处理灭菌水定容到100ML，置4保存备用。（4）TA
17、KARATAQ（5U/L）、10PCRBUFFER100MMTRISCL，PH83；500MMKCL；15MMMGCL2、DNTPMIXTURE各25MM（TAKARA公司）。（5）MS222（SIGMA公司）。214主要仪器（1）PCR仪（BIORAD公司）。（2）LX100手掌型离心机（江苏海门市麒麟医用仪器厂）。（3）SORVALLFRESCO台式高速冷冻离心机（SORVAL公司）。（4）HVE50型高压灭菌锅（HIRAYAMA公司）。（5）DK8D电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）。（6）电泳仪（北京六一仪器厂）22实验方法221鲈鱼肝脏总RNA的提取提取方法参照TRIZOLRE
18、AGENT试剂说明书，实验步骤如下（1）取液氮冻存的鲈鱼肝脏50MG左右。（2）在盛有液氮的陶瓷研钵中将组织迅速研磨成粉状。3（3）加入1MLTRIZOL，待溶解后转移到15MLDEPC水处理（01DEPC水浸泡过夜后高压灭菌）的离心管中。（4）手摇混匀15S，室温放置5MIN。（5）加入氯仿02ML，手摇混匀15S。（6）室温放置2MIN。（7）4OC，12000G离心15MIN。（8）取上清（约06ML），转移到15MLDEPC水处理的离心管中。（9）加异丙醇05ML，混匀，室温放置10MIN。（10）4OC，10000G离心10MIN。（11）弃上清，加1ML75乙醇洗涤。（12）4OC
19、，7500G离心5MIN。（13）弃上清，室温干燥510MIN。（14）DEPC处理灭菌水20L溶解，70OC保存。222肝脏常规CDNA的合成根据获得的总RNA合成CDNA17,18。（1）经微量紫外分光光度计测定RNA样品浓度。（2）在DEPC水处理的离心管中配制10L下列混合液RNA1GOLIGODTPRIMER50M1LDNTPMIXTURE各10MMOL/ML1LRNASEFREEDH2O补足到10L（3）上述混合液混匀后置PCR仪上655MIN，冰上急冷。（4）在DEPC水处理的离心管中配制下列反转录混合液上述经变性、退火的反应液10L5PRIMESCRIPTTMBUFFER4LR
20、NASEINHIBITOR40U/L05LPRIMESCRIPTTMRTASE200U/L1LRNASEFREEDH2O45L（5）混匀，PCR仪上进行如下反应；4260MIN；7015MIN；4。223鲈鱼MPEPCK开放阅读框片段的获取2231引物的设计根据实验室获得的鲈鱼MPEPCK全长CDNA序列，设计了一对用于扩增鲈鱼MPEPCK开放阅读框片段的上游引物MPEPCKF和下游引物MPEPCKR（表1）。4表1获取鲈鱼MPEPCK开放阅读框片段的引物序列TABLE1GETTINGTHEPRIMERSEQUENCEFOROPENREADINGFRAMEOFMPEPCKINLATEOLABR
21、AXJAPONICUS引物名称引物序列53MPEPCKFCATATGATGTCGTGCCTGCTGCMPEPCKRGAATTCTTAATTGTGTACTCTGTCCTC2232鲈鱼MPEPCK开放阅读框片段的PCR扩增（1）配置下列PCR反应液（50L）10PCRBUFFER5LDNTPMIXTURE4LTAKARATAQ05L上游引物MPEPCKF10MM1L下游引物MPEPCKR10MM1LCDNA模板1LPCRGRADEWATER375L（2）将上述混合液混匀，离心后置于PCR仪上，进行PCR反应。PCR扩增条件如下预变性943MIN；9430S，5630S，722MIN，进行32个循环
22、；最后72延伸5MIN。224PCR产物的纯化（1）PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，将目的片段切胶回收，称重，将胶切碎或在离心管内用1ML枪头搅碎。（2）加入等体积的溶液1，VORTER或颠倒混匀。（3）5060OC水浴加热约10分钟至胶全融，VORTER或颠倒混匀34次，以加速凝胶融解。（4）加入到DNA纯化柱内，室温放置1MIN。（5）最高速（16000G，约1200014000RPM左右）离心1MIN，倒弃收集管内的液体。（6）在DNA纯化柱内加入700微升溶液2，室温放置1MIN。（7）最高速离心1MIN，洗去杂质。倒弃收集管内的液体。（8）再加入500微升溶液2，最高速离心1MIN，进一
23、步洗去杂质。倒弃收集管内的液体。（9）最高速离心1MIN，除去残留液体并让残留的乙醇充分挥发。（10）将DNA纯化柱于15毫升离心管上，加入30微升溶液3至管内柱面上，放置1MIN。（11）最高速离心1MIN，所得液体即为高纯度DNA。225重组质粒的构建和检测2251PCR纯化产物与PMD18T载体的连接（1）经回收纯化的PCR产物与PMD18T质粒进行连接，反应体系（10L如下5PCR纯化产物47LPMD18T载体03LSOLUTIONI250L（2）将上述混合物轻轻混匀，置4连接过夜。2252重组质粒的转化（1）取5L连接产物加入100L感受态细胞悬液中，轻轻混匀，冰浴20MIN。（2）
24、42水浴90S，快速转移至冰上，冰浴25MIN。（3）加800L37预热的LB液体培养基。37200RPM振荡培养45MIN。（4）100L菌液铺于加有氨卞青霉素的LB固体培养基平板上，37培养过夜。2253重组质粒的PCR检测以PMD18T载体通用引物M13F和M13R作为上、下游引物，进行PCR检测，引物序列见表2，PCR反应体系（25L）如下10PCRBUFFER25LDNTPMIXTURE2LTAKARATAQ05L上游引物M13F10MM05L下游引物M13R10MM05L质粒DNA03LPCRGRADEWATER187LPCR反应条件如下预变性943MIN；9430S，5630S，
25、721MIN，30个循环；最后72延伸4MIN。挑选阳性克隆，提质粒。表2PMD18T载体的通用引物TABLE2GENERALPRIMEROFPMD18TVECTOR引物名称引物序列53M13FGGTAACGCCAGGGTTTTCCM13RCAGGAAACAGCTATGACC226鲈鱼PET28AMPEPCK的构建和筛选（1）正向引物前加NDE酶切位点（CATATGATGTCGTGCCTGCTGC），反向引物前加ECOR酶切位点（GAATTCTTAATTGTGTACTCTGTCCTC）。（2）将提取的质粒经过NDE和ECOR双酶切后，凝胶电泳回收纯化双酶切片段。（3）将PET28质粒经过NDE
26、和ECOR双酶切后，同样凝胶电泳回收纯化双酶切片段。（4）将上述两酶切产物用T4连接酶进行粘端连接，连接产物转化DH5菌株，挑选阳性克隆测序，确认为鲈鱼MPEPCK表达载体PET28AMPEPCK1922。623结果231鲈鱼肝脏总RNA提取结果通过TRIZOL法提取了鲈鱼肝脏组织总RNA，经1琼脂糖凝胶电泳后结果见图1，图中5S、18S和28S三条条带清晰可见，说明RNA样品具有良好完整性。以该RNA为模板，合成CDNA。图1鲈鱼肝脏总RNA琼脂糖凝胶电泳结果FIG1ELECTROPHORESISPATTERNOFTOTALRNAOFLATEOLABRAXJAPONICUSLIVER232鲈
27、鱼MPEPCK开放阅读框片段利用引物MPEPCKF和MPEPCKR获得的鲈鱼MPEPCK开放阅读框为长度1908BP的片段（图2，图3），与预期大小相符。PCR产物经切胶回收、连接转化、挑克隆检测，送上海INVITROGEN生物有限公司测序，确认为鲈鱼MPEPCK的核心序列。图2MPEPCK克隆结果图FIG2THEPICTUREOFMPEPCKSCLONINGRESULT7图3鲈鱼MPEPCK开放阅读框片段FIG3THEOPENREADINGFRAMEOFMPEPCKINLATEOLABRAXJAPONICUS233重组质粒的检测以PMD18T载体通用引物M13F和M13R作为上、下游引物，进
28、行PCR检测（图4）。PCR检测表明，除4号质粒外，其余重组质粒均重组成功。8图4重组质粒检测图FIG4THEPICTUREOFDETECTINGRESTRUCTURINGPLASMID234PET28AMPEPCK双酶切PET28AMPEPCK双酶切结果如图5所示。结果表明载体构建成功。PET28A质粒图如图6所示。图5PET28AMPEPCK双酶切结果图FIG5RESULTOFPET28AMPEPCKSDOUBLEENZYMECUT9图6PET28A质粒图FIG6PLASMIDFIGUREOFPET28A235PET28AMPEPCK表达测序PET28AMPEPCK的表达测序结果如图7所示
29、，测序结果和之前获得的MPEPCK开放阅读框片段序列一致，表明载体构建成功。10图7PET28AMPEPCK表达测序结果图FIG7EXPRESSSEQUENCINGRESULTDIAGRAMOFPET28AMPEPCK3讨论PEPCK作为糖代谢中重要的限速酶，在鱼类利用碳水化合物的过程中起了重要的作用。本研究通过提取鲈鱼肝脏总RNA，逆转录为CDNA,设计上下游引物获取MPEPCK的开放阅读框片段，大小为1908BP。将MPEPCK开放阅读框片段的PCR纯化产物与PMD18T质粒进行连接，获得重组质粒。将重组质粒与PET28质粒双酶切后用连接酶连接，最终获得PET28AMPEPCK。获得的表达
30、载体PET28AMPEPCK可以用于深入研究MPEPCK，包括其在糖代谢、脂代谢中的重要功能，为体外研究MPEPCK的功能提供条件。鱼类利用糖的能力较低，摄食后存在持续的高血糖现象，具有天生“糖尿病体质”，说明鱼类糖代谢机制与人等高等脊椎动物存在着差异。而在鱼类养殖中饲料碳水化合物可起到节约蛋白质的效果，因此，研11究鱼类糖代谢机制在当前饲料蛋白源紧缺的情况下有着重要的现实意义。而PEPCK催化糖异生过程中的一步限速反应，草酰乙酸形成磷酸烯醇式丙酮酸，是糖异生途径中的一种重要酶，动物血糖水平的稳定部分得益于PEPCK基因表达的精确调控24,25。在哺乳动物PEPCK活性主要存在于肝、肾皮质、脂
31、肪、空肠和乳腺等组织。目前已分离克隆了虹鳟ONCORHYNWHUSMYKISS、大西洋鲑SALMONSALAR、斑马鱼DANIORERIO、黑青斑河豚TETRAODONNIGROVIRIDIS、金头鲷SPARUSAURATA、鲤鱼CYPRINUSCARPIO的PEPCKCDNA全序列或部分序列，并对其序列进行比较，研究该基因的组织表达特性以及在不同饲料配方情况下的表达。虽然目前已确认鱼类也存在2类PEPCK，但是关于这2种类型的PEPCK在鱼类各组织的表达比例尚未有明确定论，需要更多的研究加以揭示。参考文献1HANSONRW,RESHEFLREGULATIONOFPHOSPHOENOLPYRU
32、VATECARBOXYKINASEGTPGENEEXPRESSIONJANNUREVBIOCHEM,1997,665816112RESHEFL,OLSWANGY,CASSUTOH,ETALGLYCERONEOGENESISANDTHETRIGLYCERIDE/FATTYACIDCYCLEJJBIOLCHEM,2003,2783330413304163PANRATS,PLAGNESJUANEBREQUEJ,ETALHEPATICPHOSPHORENOLPYMVATCARTRAXYKINASEGENEEXPRESSIONISNOTREPRESSEDBYDIETARYCARBOHYDRATESINR
33、AINBOWTROUTOCORHYNCHUSMYKISSJJEXPBID2001,2043593654CHOICY,MINBH,JOPG,ETALMOLECULARCLONINGOFPEPCKANDSTRESSRESPONSEOFBLACKPORGYACANTHOPAGRUSSCHLEGELITOINCREASEDTEMPERATUREINFRESHWATERANDSEAWATERJGENCOMPENDOCRINOL,2007,152147535STRAUSBERGRL,FEINGOLDEA,GROUSEIHETALGENERATIONANDINITIALANALYSISOFMORETHAN1
34、5000FULLLENGTHHUMANANDMOUSECDNASEQUENCESJPINENATLACADSCIUSA,2002,992616899169036戈贤平,俞菊华,吴婷婷,等翘嘴红鲌PEPCK基因的克隆和序列分析J中国水产科学GEXIANPING,YUJUHUA,WUTINGTING,ETALMOLECULARCLONINGANDCHARACTERANALYSISOFCDNAOFPHOSPHOENOLPYRUVATECARBOXYKINASEPEPCKINERYTHROCULTERILISHAEFORMISJJFISHSCICHINA,2006,1333893967LIEBSCHE
35、RRS,RICHARDSRC,LEWISJM,ETALSEASONALFREEZERESISTANCEOFRAINBOWSMELTOSMERUSMORDAXISGENERATEDBYDIFFERENTIALEXPRESSIONOFGLYCEROL3PHOSPHATEDEHYDROGENASE,PHOSPHOENOLPYRUVATECARBOXYKINASE,ANDANTIFREEZEPROTEINGENESJPHYSIOLBIOCHEMZOOL,2006,7924114238PANSERATS,PLAGNESJUANEKAUSHIKSGLUCONEOGENICENZYMEGENEEXPRESS
36、IONISDECREASEDBYDIETARYCARBOHYDRATESINCOMMONCARPCYPRINUSCARPIOANDGILTHEADSEABREWTSPARUSAURATAJBIOEHIMBIOPHYSACTA,2002,15791,35429MATTEA,TARILW,GOLDIE,H,ETALSTRUCTUREANDMECHANISMOFPHOSPHOENOLPYRUVATECARBOXYKINASEJJBIOLCHEM,1997,2728105810810KIRCHNERS,KAUSHIKS,PANSERATSEFFECTOFPARTIALSUBSTITUTIONOFDIE
37、TARYPROTEINBYASINGLEGLUCONEOGENICDISPENSABLEAMINOACIDONHEPATICGLUCOSEMETABOLISMINRAINBOWTROUTONCORHYNCHUSMYKISSJCOMPBIOCHEMPHYSIOLAMOLINTEGRPHYSIOL,2003,134A233734711PANSERATS,MDALEF,BRQUEJ,ETALLACKOFSIGNIFICANTLONGTERMEFFECTOFDIETARYCARBOHYDRATESONGLUCOSE6PHOSPHATASEEXPRESSIONINLIVEROFRAINBOWTROUTO
38、NCORHYNCHUSMYKISSJJNUTRBIOCHEM,2000,111222912TRANULISMA,DREGNIO,CRISTOPHERSENBETA1AGLUCOKINASELIKEENZYMEINTHELIVEROFATLANTICSALMONSALMOSOLARJCOMPBIOCHEMPHYSIOL,1996,114B35391213MITHIEUXG,GAUTIERSTEINA,RAJASF,ETALCONTRIBUTIONOFINTESTINEANDKIDNEYTOGLUCOSEFLUXESINDIVERENTNUTRITIONALSTATESINRATJCOMPBIOC
39、HEMPHYSIOLBBIOCHEMMOLBIOL,2006143219520014WILTONRPUTILISATIONOFDIETARYCARBOHYDRATEBYFISHJAQUACULTURE1994,124678015BORREBAEKB,CHRISTOPHERSENBHEPATICGLUCOSEPHOSPHORYLATIONACTIVITIESINPERCHPERCAFLUVIATILISAFTERDIETARYTREATMENTSJCOMPBIOCHEMPHYSIO,2000,125338739316SANGIAOALVARELLOSS,ARJONAFJ,MARTINDELRIO
40、MP,ETALTIMECOURSEOFOSMOREGULATORYANDMETABOLICCHANGESDURINGOSMOTICACCLIMATIONINSPARUSAURATUSJJEXPBIOL,2005,208PT224291430417俞菊华,夏德全,杨弘,等RACE法分离团头鲂生长抑素全长CDNA及其序列测定J水产学报,2003,27653353918FMHMANMA,DUSHMK,MARTINGR,RAPIDPRODUCTIONOFFULLLENGTHCDNAFROMRARETRANSCRIPTSAMPLIFICATIONUSINGASINGLEGENESPECIFICOLIGO
41、NUCLEOTIDEPRIMERJPROCNATLACADSCIUSA,1988,858998900219李胜杰,白俊杰,刘碧莲,叶星,于凌云,全迎春,等大口黑鲈HEPCIDIN真核表达载体构建及表达的初步研究J淡水渔业,2009,392717520王秋艳,杜文娟,李继科,杨艳波,于波,等小鼠WNT1基因真核表达载体构建及其在大鼠成肌细胞中的表达J国际病理科学与临床杂志,2009,29319620121王春红,周秀梅,刘辉,黎江,钱其军,等小鼠SOX2基因的克隆及其原核表达载体构建J浙江理工大学学报,2010,27229720222曲宪成,崔严慧,周正峰,等团头鲂促性腺激素GTHII3亚基基因
42、5端启动子区克隆及表达载体构建J水生生物学报,2008,32455856723SWOFFORDDLPAUPPHYLOGENETICANALYSISUSINGPAMIMONYANDOTHERMETHODSMVERSION,SUNDERLANDSINAUERASSOCIATES,199824COOKJS,WELDONSL,GARCIARUIZJP,ETALNUCLEOTIDESEQUENCEOFTHEMRNAENCODINGTHECYTOSOLICFORMOFPHOSPHOENOLPYRUVATECARBOXYKINASEGTPFROMTHECHICKENJPROCNATLACADSCIUSA,1986,8320,7583758725LUCASPC,GRANNERDKHORMONERESPONSEDOMAINSINGENETRANSCRIPTIONJANNUREVBIOCHEM,1992,611131117315
