1、1本科毕业论文系列开题报告食品科学与工程水产品中产组胺微生物的分离与生物学特性一、选题的背景与意义自从中国加入世界贸易组织，对外开放制度不断加强，大力发展对外贸易，特别是发展出口贸易，其中水产品的出口也不断增加。但是水产品的安全问题，一直是制约其出口的主要瓶颈。这主要是由于水产品卫生指标控制不到位及国内外对水产品微生物控制的栅栏技术应用研究缺乏充分的微生物分类鉴定研究证据，从而不能从根本上解决产品卫生安全问题和建立有效的控制方法。组胺是水产品贮藏或加工过程中体内组氨酸经过生物化学过程（部分消化酶分解）和外源性微生物污染后产生的蛋白酶类（蛋白酶主要是脱羧酸酶类）降解鱼肉组织后产生的对产品品质（感
2、官指标）劣化或人体有一定毒害的化学物质。海产鱼类如鲐鱼、鲣鱼、青鱼、沙丁鱼、竹夹鱼、金枪鱼、秋刀鱼、沙丁鱼、朝鲜方鱼等由于体内含有组氨酸，被组胺无色杆菌，摩根氏变形杆菌等微生物污染后，会产生一定数量的组胺类成分。而组胺是人体引起炎症和过敏性疾病的主要物质，它可使病人支气管收缩和粘液分泌，患者接触变性原后，血清和支气管肺泡灌洗液中可见组胺水平增高。严重的组胺中毒是由于食用含有一定数量组胺的某些鱼类以及其他动物而引起的过敏性食物中毒。由于组胺产生的事物过敏，甚至中毒的现象屡见不鲜。迄今为止，国内对组胺控制研究一直不够深入，大部分仅仅局限于测定组胺含量的层面上，只有少数人对组胺的形成和控制做了研究。
3、据文献报道,对水产品中组胺的产生机理，以及影响组胺产生的因素（包括温度、PH值、贮藏时间、含盐度、供氧量以及添加剂）分别做了概述。另外，还有文献报道，不同种类的海鱼在不同发酵温度、不同腐败程度、以及不同NACL含量的条件下，对组胺产生规律做了详细研究，但并未对产组胺菌进行鉴定，并给出相应控制方法。本课题就从微生物角度研究入手，采用现代微生物分离鉴定技术，找到特定水产品中产生组胺的主要微生物，研究它们的生理生化特性、产酶条件，脱羧酶酶学特性，组胺扩散机制等，通过分析所得数据，再探讨它们之间的相互关系，制定出相应控制方法，为生产实践中组胺的控制提供技术支持。2二、研究的基本内容与拟解决的主要问题1
4、、水产品鱼类原料的特性研究鱼肉PH值、水分活度、盐分的测定。2、产组胺脱羧酶微生物的研究（1）、产组胺微生物的单菌形态、分离、鉴定、数量、以及生长条件的研究。（2）、产酶活性研究根据产组胺含量间接反映该微生物的产酶活性。3、产组胺微生物的生长环境研究模拟产组胺微生物的生长环境（温度、盐分、PH值），测定对产组胺含量的影响。三、研究的方法与技术路线1、原料特性研究PH值、水分活度、盐分。2、产酶菌株的分离利用筛选培养基对原料进行产组胺菌株的进行初步筛选。菌株鉴定首先利用常镜检、生理生化等常规方法鉴定菌株基本特性。3、对初步筛选得到的菌种进行分类，取12组进一步确认，判断是否产生组胺，并且得到单个
5、微生物菌种。用高效液相色谱法确定组胺的产生将筛选得到的菌种接到液体培养基（含有组氨酸和胰酶大豆肉汤）上，与空白对照，判断是否是产组胺微生物。4、产酶活性研究将分离的不同菌株接种到相同培养基上，在同一条件下培养，并跟踪监测它们的组胺含量。根据产组胺含量的多少，间接判断不同菌株产组胺脱羧酶的活性大小。测定组胺含量的方法利用GB/T5009452003水产品卫生标准和高效液相色谱法。5、菌株的产酶条件分别对不同储藏温度、含盐量、PH值下，一定时期内，对鱼体内组胺含量进行跟踪检测。作出不同条件下，组胺含量的曲线图。研究技术路线图如下试验样品初步筛选得到产组胺菌种鉴定生理生化指标菌体及其菌落形态特征高效
6、液相色谱法确定组胺的根据菌落形态，经检验与生理生化结果分类，并分组3四、研究的总体安排与进度201010820101130查阅资料，完成开题报告、文献综述、开题论证；20101212011420外文翻译2篇，完成实验研究，对分离出的微生物进行鉴定，以及其特性研究；20114212011510整理数据、书写论文，完成答辩。五、主要参考文献1LEHANEL,OLLEYJHISTAMINEFISHPOISONINGREVISITERJJFOODMICROBIOL,2000,581372刘霞,陈旭峰,乔莉,等食用马鲛鱼致急性组胺中毒28例报告J江苏预防医学,2004,15427283张蕾蕾,何平食用炮
7、弹鱼致组胺中毒31例报告J中国热带医学,2002,245134TAOZ,NAKANOT,YAMAGUCHIT,ETALPRODUCTIONANDDIFFUSIONOFHISTAMINEINTHEMUSCLEOFSCOMBROIDFISHESJFISHERIESSCIENCE,2002,68139413975曾艳,周朝虹58例扁舵鲣鱼所致组胺中毒的急救J中国热带医学,2009,947047056MOHANCO,RAVISHANKARCN,SRINIVASAGOPALTK,ETALBIOGENICAMINESFORMATIONINSEERFISHSCOMBEROMORUSCOMMERSONSTEA
8、KSPACKEDWITHO2SCAVENGERDURINGCHILLEDSTORAGEJFOODRESEARCHINTERNATIONAL,2009424114167CHANGSC，KUNGHF，CHENHC，ETA1DETERMINATIONOFHISTAMINEANDBACTERIALISOLATIONINSWORDFISHFILLETSXIPHIASGLADIUSIMPICATEDINAFOODBORNEPOISONINGJFOODCONTROL,2008,1916218ARAIT,IKEUCHIY,KISHIMOTOY,ETALCONTAMINATIONOFHISTAMINEFORMI
9、NGBACTERIAINRAWFISH,PROCESSEDFISHANDICEWATERFORFISHSTORAGEONMARKETJANNUALREPORTTOKYOMETROPILITANINSTITUTEOFPUBLICHEALTH,2007,582452469陶志华,佐藤实海水中组胺菌的分离及其理化性质分析J生物技术,2009，1914244410MANUELAVDASILVA,OLIVIAPINHO,ISABELFERREIRA,ETALPRODUCTIONOFHISTAMINEANDTYRAMINEBYBACTERIAISOLATEDFROMPORTUGUESEVACUUMPACK
10、EDCOLDSMOKEDFISHJFOODCONTROL,2002,1345746111TSAIYH,LINCY,CHIENLT,ETALHISTAMINECONTENTSOFFERMENTEDFISHPRODUCTSINTAIWANANDISOLATIONOFHISTAMINEFORMINGBACTERIAJFOODCHEMISTRY,2006,98647012陶志华,张宏梅,佐藤实鲭鱼鱼肉中组胺菌的分离及其理化性质分析J食品科学,2009，19133133213KIMURAB,KONAFAYAY,FUJIITHISTAMINEFORMATIONBYTETRAGENOCOCCUSMURIAT
11、ICUS,AHALOPHILICLACTICACIDBACTERIUMISOLATEDFROMFISHSAUCEJFOODMICROBILOGY,2001,70717714王永根,沈永伟,王剑波水产品中组胺检测方法的探讨J职业与健康,2007,4,23865715朱文慧,周德庆分光光度法测定鱼罐头中组胺的方法改进J食品科学,2008822322916金安宝水产品中组胺测定方法的改进J中国卫生检验杂志,2007,17114915017商军,华贤辉,昊剑平,等鱼粉中组胺测定方法的改进J中国饲料,2007,20374218何功浩,周四元,胡静荧光分光光度法检测组织中的组胺J华中科技大学学报（医学版）
12、,2007,4,36227527819赵新颖,焦霞,郑健,等离子色谱法测定水中的腐胺、尸胺和组胺J分析实验室,2009,289666920杨文军,马丹,张丽英,等鱼粉中有害有毒物质组胺的HPLC检测方法初探J,饲料广角,20044282921麻丽丹,巴中华酶联免疫吸附试验法检测盐渍鳀鱼中的组胺J中国酿造,2008,14858622AUGUNO,SCHNEIDERE,SCHEUERR,ETALCOMPARISONOFE1ISAANDHPLCFORTHEDETERMINATIONOFHISTAMINEINCHEESEJJAGRICFOODCHEM，1999，4751961196423蔡春平,王丹红
13、,陈晓华,等高效毛细管电泳法快速测定鱼粉中的组胺含量J,2004,2330130324LIAOWENTA,PAEKHAN,MABUNICLAYTON,ETALUSEOFCAPILLARYELECTROPHORESISWITHUVDETECTIONASASCREENINGMETHODTODETERMINEHISTAMINEINFISHSAMPLESJJOURNALOFCHROMATOGRAPHY,199985354154425李佐卿,谢东华,王宇,等高效液相色谱荧光检测器快速测定水产品中的组胺J光谱实验室,2000,9559259526PREVIATIM,RASPADORIA,BERTOLASO
14、L,ETALDETERMINATIONOFHISTAMINEINTHEWHOLEBLOODOFCOLONCANCERPATIENTSJJCHROMATOGRBANALTECHNOLBIOMEDLIFESCI,2002,78023313395毕业论文文献综述食品科学与工程水产品中组胺生成菌的分离及理化性质研究摘要对水产品中组胺生成菌进行生化实验和环境因素影响实验，为食品中组胺的产生预防及质量控制提供理论基础，确保食品的安全性。利用筛选培养基对水产品中菌进行初步筛选，高效液相色谱法确定组胺的产生菌株，然后通过生物化学实验和环境因素（T、PH、盐分）影响实验，进而对组胺生成菌进行分析。最终分离得到一
15、株菌株，为沙门氏菌。关键词水产品组胺生成菌；生物化学；环境因素0前言鱼肉组胺含量超标而引起的中毒事件时有发生15，主要因为鱼肉中的组氨酸在组胺酸脱羧酶的作用下，发生脱羧反应而产生组胺6。组胺生成菌普遍存在于海水环境中，也生活在活鱼的鳃和内脏中。组胺一旦污染鱼体，在常温下会使组胺大量蓄积，人摄取了蓄积一定量组胺的鱼体后，容易引起组胺中毒现象7,8。当鱼体存活时，该细菌不对鱼产生危害，一旦鱼死亡，鱼的防御系统被破坏，在适宜温度下，组胺微生物就迅速生长并产生组胺。某些捕捞方法也会促进鱼体快速死亡，随着鱼体温度上升，组胺微生物繁殖速度加快，进而能够迅速积累组胺。能够引起组胺中毒，主要是海产鱼类（鲐鱼、
16、鲭鱼、秋刀鱼、沙丁鱼、金枪鱼、竹夹鱼、沙丁鱼、长嘴鱼等）611。1组胺生成菌的分离筛选11菌株的分离与培养本实验利用L组氨酸胰酪胨大豆肉汤发酵培养基进行初步筛选，从腮中筛选出细菌X1X5，从内脏中筛选出细菌J1J5，共10株菌。利用常镜检、生理生化等常规方法鉴定菌株基本特性。L组氨酸胰酪胨大豆肉汤发酵培养基配方L组氨酸10G，大豆蛋白胨17G，NACL30G，磷酸氢二钾25G，丙酮酸钠100G，葡萄糖25G，蒸馏水1000ML，调PH70，分装试管，121蒸汽灭菌15MIN，冷却。陶志华、佐藤实12利用组氨酸肉汤培养液对海水中组胺生成菌进行初步筛选，其配方为蛋白胨10G，酵母3G，葡萄糖5G，
17、组氨酸5G，海水500ML，蒸馏水500ML，PH65。121蒸汽灭菌20MIN。HERNANDEZHERRERO等人13从熟制盐腌凤尾鱼中分离出耐盐嗜盐组胺形成菌，并且研究了氯化钠对这些细菌形成组胺的影响。KARNOP14从半保藏凤尾鱼中分离了一种产组胺的优势6菌株嗜盐菌，鉴定为嗜盐片球菌（PEDIOCOCCUSHALOPHILUS），依据现在的分类学嗜盐片球菌（PEDIOCOCCUSHALOPHILUS）属于嗜盐四联球菌（THALOPHILUS）。因此，它很可能是无论嗜盐四联球菌（THALOPHILUS）还是盐水四联球菌（TETRAGENOCOCCUSMURIATICUS）中组胺形成菌在腌
18、制食品的产品中普遍存在，并且在组胺形成中发挥重要作用。12组胺生成菌的确定本实验将疑似菌株接种至组胺发酵培养基中，培养24H后，发酵液丹磺酰氯衍生，高效液相色谱法进行分析，最终J2菌株检测到组胺。陶志华、佐藤实12组胺生成菌确定实验是通过SATO开发的组胺检测装置来测定15。具体取10L清液于直径6MM的圆型滤纸片上，同时取10L1MG/ML的标准样品进行对照实验。然后放置在用醋酸缓冲液（PH37）浸润的H孔型的滤纸上，在800V的电压下泳动10MIN。泳动后的滤纸干燥后，用PAULY发色液喷雾发色，干燥，画像处理，通过与标准样品对照确认。通过筛选，海水分离到2株组胺细菌。根据微生物的分类与鉴
19、定，通过对细菌的形态及其生理生化特征的分析，初步鉴定出这两种菌与ACINETOBACTERMORAXELLAGROUPI、FLAVOBACTERIUMGROUPI的一些特征基本一致。对于生物胺的测定方法薄层色谱法（TLC），离子交换色谱法（IEC），气相色谱法（GC），尤其是高效液相色谱法（HPLC）已经被提出。毛细管电泳法（CZE）也有较好的结果。2菌株形成组胺的条件研究加工和贮藏环境条件不但影响组胺产生菌的活性，同时也能够影响组胺酸脱羧酶的活性，这些条件主要包括温度、PH值、贮藏时间、含盐度、供氧量以及添加剂等。21盐分对组胺产生的影响一般认为组胺的生成量随盐浓度降低而升高。这是由于一方面
20、盐浓度升高，溶液渗透压随之升高，影响了细菌的正常生理活动，另一方面由于高盐度会抑制组胺酸的脱羧反应，因此组胺在高盐环境中几乎无法生成。鱼肉中组胺的生成除了与盐浓度有关外，还与温度相关，鲭鱼贮存在5时，盐可以完全抑制组胺的生成，而与盐浓度无关；而贮存在25时，抑制组胺的生成效果与盐浓度成正比16。EVADADKOV等人17研究了不同浓度氯化钠对接种到MGYP中的盐水四联球菌30下生长和产生组胺的影响，实验结果见下表。参数培养期（天数）NACL浓度（）35715207生长量05556565355（LOGCFU/ML）27575787971474858588827818281908610807677
21、9084PH06565656565263636363634646161616476060605860105960605959组胺0NDANDNDNDND（MG/L）2NDNDNDNDND404142374NDND715973440235976850102492537041804283420结果显示组胺形成最佳NACL浓度范围57。然而，在15NACL浓度时，10天内积累组胺4283ML/L。组胺形成明显，但20NACL不能完全抑制。长时间的培养（后20天），20浓度NACL积累组胺1200MG/L（数据未显示）。22温度对组胺产生的影响陶志华、佐藤实1819从金枪鱼和鲭鱼中分离得到两株组胺生成
22、菌，并研究了不同温度下，两种菌生成组胺情况。图1金枪鱼中分离得到菌I和II不同温度下生成组胺情况图1实验结果表明菌种I从530的温度范围内，在5没有组胺生成，随着温度8升高，组胺生成量逐渐增加，最高组胺生成量在30，组胺水平达到约2700PPM。在相同条件下，菌种II在5的贮藏温度下，组氨酸脱羧酶活性比菌种I强。菌种II随着温度的升高，组氨酸脱羧酶活性也逐渐升高，但在25活性最强，组胺生长量最高，约2400PPM左右，在30的贮藏温度下，活性下降，生成组胺的量约为2100PPM。图2鲭鱼中分离得到菌和II不同温度下生成组胺情况图2实验结果表明菌II在20时组氨酸脱羧酶活性最强。所以，这类组胺菌
23、一旦污染鱼体，在常温下会使组胺大量蓄积，人摄取了蓄积一定量组胺的鱼肉后，容易引起组胺中毒现象2021。23PH值对组胺产生的影响PH对酶反应速度的影响非常明显，每一种酶只能在一定PH范围内有活性，PH值过高或过低都会影响酶分子构象的稳定性，也可以影响酶分子极性基团的解离状态，使其电荷性发生变化。PH值是影响生物胺生成最重要的环境因素，它可以影响细菌的代谢活力和代谢方向。PH值在4055范围内的酸性环境会增加氨基酸脱羧酶的活性，当PH值很低时鲭鱼体内酪胺含量会急剧升高。此外，在酸性条件下鱼体内的组织蛋白酶活力增强，降解鱼肌肉蛋白质形成更多的多肽和氨基酸，这些多肽和氨基酸经氨基酸脱羧酶作用后形成各
24、种生物胺。供氧量、水分活度及其添加剂都对组胺的产生有一定影响。如当空气中CO2含量达到80时，摩根氏变形杆菌（PROTEUSMORGANII）的组氨酸脱羧酶的活性会受到抑制。3、组胺的控制赖小玲等人22测定了7种海产品在冷藏、冻藏、室温等条件下储藏或放置期间组胺含量的变化，观察了各海产品在上述条件下其品质的劣变情况。结果显示冻藏是海产品较为理想储藏方法，其组胺含量增加缓慢，品质的劣变不明显；冷藏下海产品的组胺含量增加及品质劣变较快；室温下和室温盐水中放置，组胺含量的增加很快，品质的劣变明显，24H内9就直接影响其可食性。PHUVASATE等人，发现电解氧化水及其冰能够有效地减少鱼体或其接触容器
25、表面产组胺微生物的数量23。KUDA等人，发现大米抛光的副产品（米糠）中的一种水溶性、耐热的高分子量化合物，能够有效减少雨露中组胺的含量24。EMBORG等人，研究发现气调保鲜（40CO2和60O2）能够有效抑制摩根氏菌和发光细菌的生长及其组胺的产生25。PARAMASIVAM等人，发现天然防腐剂大蒜、姜黄和生姜提取物能够抑制产组胺微生物（芽孢杆菌等）的生长26。4、结束语组胺的产生和控制目前随已进行了一些研究，但是组胺产生机理方面还缺乏深度，组氨酸与其脱羧酶的作用机制还需要进一步研究；组胺控制方面也缺乏广度，更多更好的方法需要进一步发现。随着人们对食品安全越来越重视，要求越来越高，并且国外对
26、进口食品中组胺含量的检出限要求提高，食品中组胺的产生和控制已经成为研究者的热点。国外对组胺的相关研究较国内要进行的深入并且全面，包括组胺的萃取、分离、检测分析等、形成机理和控制方法等各个方面，且自从中国加入世界贸易组织，对外开放制度不断加强，大力发展出口贸易，其中国内水产品、酒类、豆制品等出口也不断增加，但是组胺问题一直是制约食品出口的主要瓶颈，因此组胺产生和控制的研究刻不容缓。食品中的组胺问题已经引起食品安全等许多学科的重视，并随着科研工作者对组胺产生机理的认识以及生物技术的快速发展，相信在不久的将来组胺会得以控制。参考文献1LEHANEL,OLLEYJHISTAMINEFISHPOISON
27、INGREVISITERJFOODMICROBIOLOGY,2000,581372刘霞,陈旭峰,乔莉,等食用马鲛鱼致急性组胺中毒28例报告J江苏预防医学,2004,15427283张蕾蕾,何平食用炮弹鱼致组胺中毒31例报告J中国热带医学,2002,245134TAOZ,NAKANOT,YAMAGUCHIT,ETALPRODUCTIONANDDIFFUSIONOFHISTAMINEINTHEMUSCLEOFSCOMBROIDFISHESJFISHERIESSCIENCE,2002,68139413975曾艳,周朝虹58例扁舵鲣鱼所致组胺中毒的急救J中国热带医学,2009,947047056MOH
28、ANCO,RAVISHANKARCN,SRINIVASAGOPALTK,ETALBIOGENICAMINESFORMATIONINSEERFISHSCOMBEROMORUSCOMMERSONSTEAKSPACKEDWITHO2SCAVENGERDURINGCHILLEDSTORAGEJFOODRESEARCHINTERNATIONAL,2009424114167CHANGSC，KUNGHF，CHENHC，ETA1DETERMINATIONOFHISTAMINEANDBACTERIALISOLATIONINSWORDFISHFILLETSXIPHIASGLADIUSIMPLICATEDINAFO
29、ODBORNEPOISONINGJFOODCONTROL,2008,191621108ARAIT,IKEUCHIY,KISHIMOTOY,ETALCONTAMINATIONOFHISTAMINEFORMINGBACTERIAINRAWFISH,PROCESSEDFISHANDICEWATERFORFISHSTORAGEONMARKETJANNUALREPORTTOKYOMETROPILITANINSTITUTEOFPUBLICHEALTH,2007,582452469宋京玲一起食用日本鲭鱼引起的组胺食物中毒报告J职业与健康，2005,21222722810徐金德一起秋刀鱼引起组胺食物中毒事件的
30、调查J海峡预防医学杂志,2004,1054111TSAIY,HSIEHH,ETALHISTAMINELEVELANDSPECIESIDENTIFICATIONOFBILLFISHMEATSIMPLICATEDINTWOFOODBORNEPOISONINGSJFOODCHEMISTRY,2007,10441366137112陶志华,佐藤实海水中组胺菌的分离及其理化性质分析J生物技术,2009，191424413HERNANDEZHERRERO,MM,ROIGSAGUES,AX,RODRIGUEZJEREZ,MORAVENTURA,MT,1999HALOTORELANTANDHALOPHILICH
31、ISTAMINEFORMINGBACTERIAISOLATEDDURINGTHERIPENINGOFSALTEDANCHOVIESENGRAULISENCRASICHOLUSJFOODPROT62,50951414KOBAYASHI,T,KIMURA,B,FUJII,T,2000DIFFERENTIATIONOFTETRAGENOCOCCUSPOPULATIONSOCCURRINGINPRODUCTSANDMANUFACTURINGPROCESSOFPUFFERFISHOVARIESFERMENTEDWITHRICEBRANINTJFOODMICROBIOL56,21121815SATOM,T
32、AOZ,SHIOZAKIK,ETALASIMPLEANDRAPIDMETHODFORFISHHISTAMINEANALYSISBYPAPERELECTROPHORESISJFISHERIESSCIENCE,2006,7288989216金安宝水产品中组胺测定方法的改进J中国卫生检验杂志,2007,17114915017商军,华贤辉,昊剑平,等鱼粉中组胺测定方法的改进J中国饲料,2007,20374218何功浩,周四元,胡静荧光分光光度法检测组织中的组胺J华中科技大学学报（医学版）,2007,4,36227527819赵新颖,焦霞,郑健,等离子色谱法测定水中的腐胺、尸胺和组胺J分析实验室,200
33、9,289666920杨文军,马丹,张丽英,等鱼粉中有害有毒物质组胺的HPLC检测方法初探J,饲料广角,20044282921麻丽丹,巴中华酶联免疫吸附试验法检测盐渍鳀鱼中的组胺J中国酿造,2008,14858622AUGUNO,SCHNEIDERE,SCHEUERR,ETALCOMPARISONOFE1ISAANDHPLCFORTHEDETERMINATIONOFHISTAMINEINCHEESEJJAGRICFOODCHEM，1999，4751961196423蔡春平,王丹红,陈晓华,等高效毛细管电泳法快速测定鱼粉中的组胺含量J,2004,2330130324LIAOWENTA,PAEKH
34、AN,MABUNICLAYTON,ETALUSEOFCAPILLARYELECTROPHORESISWITHUVDETECTIONASASCREENINGMETHODTODETERMINEHISTAMINEINFISHSAMPLESJJOURNALOFCHROMATOGRAPHY,199985354154425李佐卿,谢东华,王宇,等高效液相色谱荧光检测器快速测定水产品中的组胺J光谱实验室,2000,955925951126PREVIATIM,RASPADORIA,BERTOLASOL,ETALDETERMINATIONOFHISTAMINEINTHEWHOLEBLOODOFCOLONCANC
35、ERPATIENTSJJCHROMATOGRBANALTECHNOLBIOMEDLIFESCI,2002,780233133912本科毕业设计（20_届）水产品中产组胺微生物的分离与生物学特性13目录诚信承诺I目录II摘要IV1前言错误未定义书签。2材料与方法错误未定义书签。21实验材料错误未定义书签。211原料错误未定义书签。212仪器与设备错误未定义书签。213试剂和培养基222测定方法3221鲣鱼成分分析3222高效液相色谱法测定组胺3223J2菌株的生理生化实验423实验方法5231组胺生成菌的分离筛选5232J2菌株生长曲线5233环境因素对J2菌株生长的影响52331温度对J2菌株
36、生长的影响52332PH值对J2菌株生长的影响5234环境因素对J2菌株组胺生成量的影响62341温度对J2菌株组胺生成量的影响62342PH值对J2菌株组胺生成量的影响63结果与分析631鲣鱼成分分析632组胺生成菌的分离筛选633待测菌株产组胺能力测定634J2菌株生长曲线71435J2菌株生理生化实验736环境因素对J2菌株生长的影响7361温度对J2菌株生长的影响7362PH值对J2菌株生长的影响837环境因素对J2菌株组胺生成量的影响8371温度对J2菌株组胺生成量的影响8372PH值对J2菌株组胺生成量的影响94结论9参考文献10致谢1115【摘要】鉴别培养基初步筛选共得到10株菌
37、株，并且利用高效液相色谱法检测到其中一株菌株在含10L组氨酸胰酶蛋白大豆肉汤中有组胺产生。对水产品中的组胺生成菌进行生化实验和环境因素对其生长和组胺生成量的影响实验，为生产实践中组胺的控制提供可参考数据。该菌株的最适生长温度和PH分别为30和7。同时，25检测到该菌株组胺最大生成量549UG/ML，PH为5时检测到组胺最大生成量986UG/ML。该菌株初步鉴定为芽孢杆菌BACILLUSSPP。【关键词】水产品；组胺生成菌；生物化学【ABSTRACT】ATOTALOFTENBACTERIALSTRAINSWERESELECTEDFROMTHEPRESCREENINGSTEPUSINGPRELIM
38、INARILYDIFFERENTIALMEDIUM,ANDONEOFTHEPOSITIVEISOLATESWERETRUEHISTAMINEFORMERSWHENCONFIRMEDBYHPLCMETHODINTRYPTICASESOYBROTHSUPPLEMENTEDWITH10LHISTIDINETHEPHYSIOLOGICALANDBIOCHEMICALEXPERIMENTSANDENVIRONMENTALFACTORSONGROWTHANDHISTAMINEFORMATIONOFHISTAMINEFORMINGBACTERIAWERECONDUCTEDTOPROVIDEREFERENCE
39、DATAFORHISTAMINECONTROLINPRODUCTIONTHEOPTIMUMTEMPERATUREANDPHOFGROWTHWERE30AND7,RESPECTIVELYATTHESAMETIME,ITCOULDPRODUCE549UG/MLAND986UG/MLHISTAMINEATOPTIMUMTEMPERATURE25ANDOPTIMUMPH5FINALLY,THESTRAINWASPRELIMINARILYIDENTIFIEDASBACILLUSSPP【KEYWORDS】AQUATICPRODUCTSHISTAMINEFORMINGBACTERIABIOCHEMISTRY
40、11前言自从中国加入世界贸易组织，对外开放制度不断加强，大力发展对外贸易，特别是发展出口贸易，其中水产品的出口也不断增加。但是水产品的安全问题，一直是制约其出口的主要瓶颈。这主要是由于水产品卫生指标控制不到位及国内外对水产品微生物控制的栅栏技术应用研究缺乏充分的微生物分类鉴定研究证据，从而不能从根本上解决产品卫生安全问题和建立有效的控制方法。组胺是水产品贮藏或加工过程中体内组氨酸经过生物化学过程（部分消化酶分解）和外源性微生物污染后产生的蛋白酶类（蛋白酶主要是脱羧酸酶类）降解鱼肉组织后产生的对产品品质（感官指标）劣化或人体有一定毒害的化学物质1。海产鱼类如鲐鱼、鲣鱼、青鱼、沙丁鱼、竹夹鱼、金枪
41、鱼、秋刀鱼、沙丁鱼、朝鲜方鱼等由于体内含有组氨酸，被组胺无色杆菌，摩根氏变形杆菌等微生物污染后，会产生一定数量的组胺类成分。而组胺是人体引起炎症和过敏性疾病的主要物质，它可使病人支气管收缩和粘液分泌，患者接触变性原后，血清和支气管肺泡灌洗液中可见组胺水平增高24。严重的组胺中毒是由于食用含有一定数量组胺的某些鱼类以及其他动物而引起的过敏性食物中毒。由于组胺产生的事物过敏，甚至中毒的现象屡见不鲜。微生物污染产生组胺的三个条件56（1）存在组胺的前体物质自由组氨酸；（2）存在催化酶组氨酸脱羧酶（主要由微生物产生）；（3）存在发生组氨酸脱羧反应的条件。水产鱼类，尤其是中上层的青皮红肉鱼，体内含有丰富
42、的自由组氨酸。一旦此类鱼或其产品中存在产组胺微生物，在适宜条件下，极易产生组胺。它们广泛存在于未经加工的鱼或其产品（发酵、腌渍、干制和其它鱼肉制品）中。迄今为止，国内对组胺控制研究一直不够深入，大部分仅仅局限于测定组胺含量的层面上，只有少数人对组胺的形成和控制做了研究。有相关文献对水产品中组胺的产生机理，以及影响组胺产生的因素（包括温度、PH值、贮藏时间、含盐度、供氧量以及添加剂）分别做了概述。另外，还有文献报道，不同种类的海鱼在不同发酵温度、不同腐败程度、以及不同NACL含量的条件下，对组胺产生规律做了详细研究，但并未对产组胺菌进行鉴定，并给出相应控制方法。本课题就从微生物角度研究入手，采用
43、现代微生物分离鉴定技术，找到特定水产品中产生组胺的主要微生物，研究它们的生理生化特性、环境因素对其生长和产酶活性的影响。通过分析所得数据，再探讨它们之间的相互关系，制定出相应控制方法，为生产实践中组胺的控制提供技术支持。2材料与方法21实验材料211原料冷冻鲣鱼（捕捞后30速冻，18保藏），浙江舟山企业提供（2010年4月）。此鲣鱼捕捞于中国东海。212仪器与设备ALC2103电子天平ACCULAB有限公司DHG9070AS新型电热恒温鼓风干燥箱宁波江南仪器厂ANKETGL16C离心机上海安亭科学仪器厂WH861漩涡混合器湖州兰月光电仪器设备有限公司2DHG9140电热恒温鼓风干燥箱广东省医疗
44、器械厂XSP2CA普通光学显微镜上海永亨光学仪器制造有限公司LRH190S恒温恒湿培养箱广东省医疗器械厂LDZX40BI立式蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂SB4200D超声波清洗机宁波新芝生物科技股份有限公司安捷伦LC1100液相色谱仪上海智岩科学仪器有限公司AGLIENTTCC18色谱柱25046MM，5UM上海楚定分析仪器有限公司PHS25型数显PH计上海精密科学仪器有限公司其他仪器量筒、离心管、烧杯、移液管、三角锥形瓶、试管、试剂瓶、滴定管、容量瓶、玻璃棒、培养皿、移液枪、剪刀、酒精灯、镊子、牙签等。2213试剂和培养基试剂氢氧化钠分析纯无锡市佳妮化工有限公司氨水分析纯广东省化学试剂工程技
45、术研究开发中心碳酸氢钠分析纯宜兴市第二化学试剂厂高氯酸分析纯上海化学试剂总厂所属上海二厂氯化钠分析纯宜兴市第二化学试剂厂葡萄糖分析纯广东省化学试剂工程技术研究开发中心乙酸铵分析纯温州市化学用料厂磷酸氢二钾分析纯上海化学试剂总厂所属上海二厂牛肉浸膏生化试剂上海化学试剂公司酵母膏生化试剂上海酵母厂胰蛋白胨生化试剂北京陆桥商检新技术公司蛋白胨生化试剂国药集团化学试剂有限公司丙酮色谱纯北京益利精细化学品有限公司乙腈色谱纯北京益利精细化学品有限公司丹磺酰氯色谱纯ACROS组胺标准品色谱纯SIGMA1,7二氨基庚烷色谱纯阿拉丁培养基普通营养琼脂培养基蛋白胨10G，牛肉膏3G，氯化钠5G，琼脂15G，蒸馏水
46、1000ML，加热溶化，调PH72，冷却至4050保存备用。初步筛选培养基胰蛋白胨5G，酵母膏5G，L组氨酸2G，NACL5G，琼脂15G，甲酚红02G，蒸1000ML，加热溶化，调PH65，121灭菌15MIN，冷却至4050保存备用。运动性检测培养基蛋白胨5G，牛肉膏25G，酵母25G，葡萄糖1G，琼脂20G，海水500ML，蒸馏水500ML，加热溶化后，调PH70，分装试管，121蒸汽灭菌20MIN，冷却后备用。产酸产气检测培养基蛋白胨10G，酵母3G，葡萄糖5G，组氨酸5G，海水500ML，蒸馏水500ML，调PH65，分装装有小导管的试管，12L蒸汽灭菌20MIN，冷却后备用。淀粉水
47、解培养基蛋白胨10G，氯化钠5G，牛肉膏5G，可溶性淀粉2G，蒸馏水1000ML，琼脂15G，121蒸汽灭菌20MIN，冷却至4050保存备用。蛋白胨水培养基蛋白胨10G，氯化钠5G，蒸馏水1000ML，调PH75，分装试管，121蒸汽灭菌20MIN冷却后备用。葡萄糖蛋白胨水培养基蛋白胨5G，葡萄糖5G，磷酸氢二钾2G，蒸馏水1000ML，调PH72，分装试管，112蒸汽灭菌20MIN，冷却后备用。明胶液化检测培养基牛肉膏03G，蛋白胨1G，氯化钠05G，明胶15G，蒸馏水100ML，2加热溶化后，调调PH72，分装试管，121蒸汽灭菌20MIN，冷却后备用。初步筛选培养基胰蛋白胨5G，酵母膏
48、5G，L组氨酸2G，NACL5G，琼脂15G，甲酚红02G，蒸馏水1000ML，加热溶化，调PH65，121灭菌15MIN，冷却至4050保存备用。L组氨酸胰酪胨大豆肉汤发酵培养基L组氨酸10G，大豆蛋白胨17G，NACL30G，磷酸氢二钾25G，丙酮酸钠100G，葡萄糖25G，蒸馏水1000ML，调PH70，分装试管，121蒸汽灭菌15MIN，冷却后备用。22测定方法221鲣鱼成分分析鲣鱼PH的测定将10G鱼肉组织匀浆与90ML蒸馏水混合，制成较稠的浆液，用一台PH计测定。鲣鱼盐分的测定样品处理按固液比例，取具有代表性样品至少200G，去除不可食部分，用研钵或组织捣碎机捣碎，混匀。取样品5G
49、于30ML瓷坩埚中，在130烘箱中烘干。在电炉上碳化至无烟，放入550600高温炉中灼烧2H，取出放冷后，在坩埚内加入少量水用玻璃棒捣碎并研磨均匀转移入100ML容量瓶中定容至刻度，混匀，过滤，取滤液备用。滴定准确移取制备的样品液适量（含氯化钠50100MG，含量低的样品可采用全量分析），于250ML三角瓶中，加水至约100ML（必要时，加23滴百里香酚蓝指示剂，用01MOL/LHNO3或01MOL/LNAOH滴定至刚显淡蓝色，PH值在65105之间），加05ML10铬酸钾指示剂，用01MOL/L的硝酸银标准液滴定至刚显砖红色为终点，同时做一试剂空白对照。鲣鱼水分含量的测定称量皿称取一定量的样品，记录质量，后将称量皿放入烘箱内，盖子应该打开，斜放在旁边，取出时先改好盖子，用纸条取，放入干燥器内，冷却后称重。干燥温度设定为105，每隔一定时间称量一次，直至最后两次重量之差2MG，基本保证水分蒸发完全。鲣鱼挥发性盐基氮的测定样品处理将鲣鱼除去不可食部分，绞碎搅匀，称约100G，置于锥形瓶中，加100ML水，不时震摇，浸渍30MIN后过滤，滤液置冰箱备用。蒸馏滴定将盛有10ML吸收液及5滴6滴混合指示液的锥形瓶置于冷凝管下端，并使其下端插入吸收液的液
