1、 本科毕业论文 （ 20 届） 海洋放线菌作为微生物源杀虫剂的试验 所在学院 专业班级 生物科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 本科毕业论文 目录 目录 摘要 .I Abstract . II 引言 . 1 1 材料与方法 . 2 1.1 样品来源与供试虫源 . 2 1.2 培养基 . 2 1.3 海葵共附生放线菌的分离 . 2 1.4 菌株发酵与发酵液提取、热处理 . 3 1.5 卤虫毒性实验 . 3 2 结果 . 4 2.1 分离到的海葵共附生放线菌 . 4 2.2 发酵提取液 . 6 2.3 菌株杀虫活性的筛选结果 . 6 2.4 菌株 DH102 发酵提取液杀虫活性
2、的稳定性试验结果 . 8 3 讨论 . 9 3.1 海葵共附生放线菌的分离 . 9 3.2 发酵提取液杀虫活性及其稳定性 . 9 3.3 海洋无脊椎动物共附生放线菌作为生物农药的潜在价值 . 10 3.4 海洋杀虫活性物质生物筛选技术的发展方向讨论 . 10 参考文献 . 11 致谢 .错误 !未定义书签。 本科毕业论文 中文摘要 I 摘要 摘要 近年来，随着人们对环境污染的重视程度的提高，社会呼吁取代或减少有机杀虫剂使用的要求随之不断高涨。天然产物源于自然，经过无数年的优 化组合，可能更适应农业可持续发展的要求，人们转而从自然界寻找新的生物源杀虫剂。从海洋生物中寻找杀虫活性成分是目前杀虫剂研
3、究的热点之一。本文 从舟山朱家尖海域的海葵经过分离纯化得到 4株共附生海洋放线菌，利用用卤虫毒性测定法进行了杀虫活性菌株的初步筛选以及稳定性 的复筛，在初筛后，发现 24h后卤虫死亡率高于 90%的菌株有 DH101，DH102， DH104等 3株，对杀虫活性最强的 1株菌株 DH102进行温度稳定性检测，发现菌株发酵提取液对于温度较敏感，在 60 丧失一半的活性而在 90 ， 杀虫活性消失。实验结果表明表明菌株 DH102的发酵液提取产物具有较高的杀虫活性，有作为生物农药资源微生物的研究开发潜力。 关键词 生物源杀虫剂；海洋放线菌；杀虫活性； 筛选 本科毕业论文 英文摘要 II Abstr
4、act Abstract In recent years, as people on the importance of environmental pollution improvement in the level of social calls to replace or reduce the requirement to use organic pesticides followed rising. Natural products derived from nature, after countless years of excellent Of the combination, m
5、ay be more to adapt to the requirements of sustainable development of agriculture, people turned to nature to find new biological insecticide. From marine organisms in the search for insecticidal active ingredient is one of the hot pesticides. This article from the Zhoushan sea area in the quagmire
6、of Dinghai mud samples obtained after purified 30 marine actinomycetes, with Artemia liquid insecticidal activity determination were the primary screening and secondary screening strains in screening, we found that 24h after the halogen insect mortality rate higher than 90% of the strains had DH102,
7、 DH103, DH107, DH109, DH201, DH203, DH204, DH207, DH210, DH301, DH303, DH306, DH308 and other 13 strains, for which 13 isolates were re-screened, found that several strains of Artemia in the fermentation broth for the ID50 high, but then processed through freeze-thaw, some strains of the insecticida
8、l activity of a sudden or gradual extinction, and DH109, DH204 and then treated by freezing and thawing on the ID50 Artemia still higher than the 100 or more. The results show that indicated that the strain DH109, DH204 and stable high insecticidal activity. Key words Biological insecticide ； Insect
9、icidal； activity of marine actinomyces； screening 本科毕业论文 引言 1 引言 当今，微生物源的药物是天然药物 的极其重要的组成部分之一。可是，通过几十年的长时间的开发研究，想要从陆栖微生物中找到新的活性物质的几率已经变得越来越小，筛选的难度也变得越来越大。因此，以开发生态环境以及物种分布与陆地微生物有很大区别的海洋微生物资源来寻找新型的微生物源药物将会成为研究的必然趋势。 1-3 众所周知，海洋是生命之源，也是地球上包含物质资源最丰富的领域。根据报道，地球上的物种约有 80 都 生活在水中，在这其中除了我们所熟悉的鱼、虾、贝类之外，仅仅是较低
10、等的海洋生物物种就达到了将近 200000多 种，海生植物也有大约 20000多种 。海洋生物和陆地生物有着很大的不同，由于海洋生物的生存环境极其艰难恶劣 (高盐、高压、缺氧等 )，为了生存下来并竞争更多的生存空间，很多的海洋生物在长期不断的进化过程中能够自身代谢产生一些结构独特复杂的化学物质，这种物质就被称为次生代谢产物。这些化学物质的主要功能是用于防范天敌的进攻，防止一些海洋真菌、海洋微生物或藻类在海洋生物的肌体上附集，以及用于物种之间的信息传递等，从而使该物种得以进化生存 4-5 。海洋生物体内的生物活性物质和代谢产物的复杂性、特殊性和多样性，为人类寻找新的天然产物提供了有利的条件。现
11、代的药理研究结果表明很多海洋生物的次生代谢产物对害虫有较好的防范效果 ，从而引起了生物学家、化学家、医药学家等的极大兴趣。科学家们预测，海洋科技是 21世纪人类最可能取得生物科技突破的领域之一 并预言 2l世纪将是海洋世纪。 本科毕业论文 材料与方法 2 1 材料与方法 1.1 样品来源与供试虫源 海葵样品采自舟山东部朱家尖海域。供试虫源为卤虫，卤虫材料由 山东 颖顺 水产开发有限公司包装生产 。 测定时，卤虫卵于人工海水 (用海水素按使用说明配制 ,pH 7.5 8.5 ) 28 活化 24 h。 1.2 培养基 分离培养基用改良高氏一号培养基： 可溶性淀粉 20 g， NaCl 0.5 g
12、， KNO3 1 g，K2HPO43H2O 0.5 g， MgSO47H2O 0.5 g， FeSO47H2O 0.01 g， 琼脂 15 20 g， 人工海水 1000mL， pH 7.4 7.6， 121 高 压灭菌 20 min。另外也试验了含有酪蛋白的 CSA培养基。 发酵培养基用蛋白胨 10g, 酵母提取物 2g, 面粉 2g, 人工海水 1000ml, pH 7.8。 1.3 海葵共附生放线菌的分离 高氏一号培养基 ( 人工海水 ) 为分离培养基。使用前加入终浓度为 5010 -6的重铬酸钾作为细菌和真菌的抑制剂。 将采集到的海葵样品先用 0.2m 滤膜过滤除菌的海水充分冲洗数次，
13、以除去海葵表面松散附生的微生物，然后用 70%的乙醇浸泡 3min，做表面消毒，再用除菌海水洗净残留乙醇。用无菌刀片小心削割，切取小块组织于灭菌 Eppendorf 管中研磨，然后加入 1ml 灭菌海水，振荡混匀即得组织匀浆。以上匀浆做 10-1、 10-2、 10-3、 10-4 倍的梯度稀释。吸取四个稀释浓度即原液、 10-1、 10-2、 10-3，各 200l涂布于高氏 I 号和 CSA 分离培养基平板，每个浓度 3 个重复。 将涂布好的平皿放入恒温培养箱培养，于 28 下培养 21-28天。 本科毕业论文 材料与方法 3 1.4 菌株发酵与发酵液提取、热处理 纯化后的菌株经斜面活化后
14、，将孢子用无菌水洗下制成孢子悬液，接种 于发酵培养基 ( 250 mL 锥形瓶装液量 30 mL)， 28 130 r/min 摇床培养 5.5 d；发酵结束后， 将培养好的发酵液 离心过滤 ， 辅以流动水 减压抽滤，滤液 在分液漏斗 用 250ml乙酸乙酯萃取得 提取 液；滤渣用乙酸乙酯浸泡超声波提取 30min，过滤得滤液。合并上述乙酸乙酯提取液，用 EYELA旋转蒸发仪蒸干，再用氯仿 /甲醇溶解转移到 Eppendorf管中， 各菌株的发酵提取液分别 用 1:1的氯仿 /甲醇定容至 1ml，置于 4C冰箱中保存备用。 发酵提取液的热处理于水浴锅中进行，装有提取液的 EP 管于水的表面加热
15、至 60和 90 ，充分加热 2h, 温度计测定温度，冷却至室温后测定杀虫效应。 1.5 卤虫毒性实验 采用卤虫液体测定法 6, 7以 96 孔细胞培养板进行。先加入提取液母液（浓度2mg/mL） 200L 到每排第 1 孔，依次吸出 100L 到下一孔混匀，用乙酸乙酯进行梯度稀释，产生不同的浓度梯度；待溶剂充分挥发干后每排的每孔先加入 100L 人工海水（盐度 28 ， pH8-9）最后加入 100L 含孵出 24h 内的卤虫幼体约 20 个左右的人工海水。 96 孔板放置恒温摇床，施加不间断光照（ 60W 灯泡照明） 37 进行培养。 24h 后在体视显微镜或放大镜下观察死亡或存活的卤虫个
16、数，以大头针轻轻点击卤虫发现不动的即记为死亡。计数结束后用福尔马林溶液杀死所有尚存活的卤虫，再计算总数。 如果实验中对照组中没有死亡发生，致死率的测定为： 致死率 =死亡个数 /总虫数 这是一种绝对致死率 。 空白对照组死亡率控制在 5%以内， 如果实验时对照组中有死亡发生，则致死率的计算为： 致死率 = 对 照组的成活率 实验组的成活率。 这是一种相对致死率。实验中以空白培养基提取物作阴性对照 ，取三次重复实验的平均数计算 。 本科毕业论文 结果 4 2 结果 2.1 分离到的海葵共附生放线菌 海葵样品于 2010 年 10 月采自舟山朱家尖海域（图 1），未定种，可能为黄海葵。保鲜袋包好后
17、于 4 冰箱保存备用。 11 月对其进行放线菌分离，共分离到共附生海洋放线菌 4 株，其余分离得到的细菌和真菌类忽略不计。从海葵各个部位（图 2）分离共附生放线菌，其中获得的共附生放线菌结果见表 1.。 图 1 采样地点 （舟山朱家尖十里金沙参照 :） Figure 1 Sampling sites 本科毕业论文 结果 5 图 2 海葵示意图 （参照维库百科 ） Figure 2 Schematic diagram of a sea anemone 表 1海葵样品中共附生放线菌的分离结果 Tab.1 Symbiotic actinomycetes isolated from sea anemo
18、ne 分离部位 菌株号 触手 DH101 触手 DH102 表皮 DH103 足盘 DH104 分离到的共附生放线菌多来自于海葵的触手，足盘（底座）和体表则较少，多份样品未分出放线菌。而且发现有些在高氏 I 号培养基中不出现或生长不好的菌株在 CSA平板上出现，例如 DH103 菌株。 本科毕业论文 结果 6 2.2 发酵提取液 四株海葵共附生放线菌经发酵后，乙酸乙酯提取获得提取液置于 Eppendorff 管中（如图 3）。 图 3 海葵共附生放线菌发酵提取液 Figure 3 anemones were epiphytic Actinomycetes fermentation extrac
19、t 2.3 菌株杀虫活性的筛选结果 分离得到的 4 株放线菌中，经发酵进行提取液的杀虫试验。可以发现大多数的菌株提取物母液具有较好的杀虫效果， 24h 后卤虫死亡率高于 90%的菌株有 3 株，即菌株DH101， DH102 和 DH104 的发酵提取液 。而 稀释后的提取液中卤虫均有不同程度的存活，对照组 24h 内基本没有死亡现象，不排除有些组有一两个死亡个体。 表 2 海葵 共附生 微生物发酵提取物对卤虫的致死率 Table 2 anemones were epiphytic microbial fermentation extract on the mortality rate of Artemia 菌株 M-24h (%) DH101 94.2 DH102 98.0 DH103 19.2 DH104 91.5 从中发现菌株 DH102 的发酵后的乙酸乙酯提取液有最强的杀虫活性。形态观察结合培养特征，参照放线菌的分类和鉴定、链霉菌鉴定手册初步判断为菌株
