1、毕业论文 开题报告 环境工程 苯酚对发光菌 Q67 的急性毒性研究 一、选题的背景、意义 随着工农业生产的不断发展、城镇建设规模的日益扩大，全球环境污染日趋严重，化学品的环境污染日益突出。据报道全球目前大约有 10万多种合成化学品释放进入环境中成为环境毒物，而且还以每年 1000种新化合物的速度递增 1。苯酚、苯胺等作为重要的化工原料，其生产量和使用量占芳烃总量的 90%以上。这些物质在满足人类生产、生活需要的同时也不可避免的进入到环境中，从而给环境带来污染 2,是水环境的主要污染物之一。 美国环保局 (EPA)水质调 查发现供水系统中有机污染物 有 2110种，饮用水中含 765种。 199
2、4年以来，美国在饮用水中发现了 100多种合成有机物，如多氯联苯、多环芳烃等，具有 “ 三致 ” 作用。关于水环境中有机物的降解问题已迫在眉睫。 关于有机污染物对水环境造成影响的研究工作，国内 外 开展了很多研究，目前用得较多的检测污染生物毒性的方法是从医学毒理学的方法引用过来的小鼠或是鱼类或是藻类 进行 毒性实验。由于时间长，成本高，而不易普遍推广应用。 20 世纪 80 年代发展起来的 Microtox方法 ,采用发光细菌作为毒性测试的指标生物 ,根据测定发光强度 的减弱程度 ,判断污染物的毒性强弱 。研究表明 大部分有机污染物 的浓度与 对发光细菌 的 毒性 呈 明显正相关 3。 一般来
3、说，进行一次发光菌对污染物或毒性物质的检测实验，只要 0.5-1小时。短时间就可以知道被测试物有没有毒性或毒性多大。 发光菌的急性毒性检测由于其耗时短、成本低、反应灵敏，从而 可用于必须公示的敏感项目竣工环境验保护收的监测， 在水环境的检测中有很强的实用性和可推广前景。 我们现在使用的发光菌检测方法是将发光菌先培养好，制成冻干粉，以保存在 -20 以下的冰箱中，使用前仅需加入复苏液，几分钟之后冻干粉恢复活力，就 可以即用于检测毒性物质。 二、生态毒理学研究的现状及动态发展 1、测试方法研究现状 进入 21 世纪以来，随着科学的不断发展进步，人类合成越来越多的化学品，水环境最为工农业废物的最终排
4、放点，污染现象越来越严重超过了其自净能力，从而影响水体的正常功能，造成水体污染这些生活污水绝大多数来自城市生活污水和造纸、采矿、印染等工业废水，这些成分中有一部分属于难降解污染物其本身及其在水体中的转化产物在水体中长期积累，达到很高的浓度，不仅影响水生生物种群和群落结构的变化，而且严重时将导致水生生态系统的破坏和崩溃。水体污染物 达到一定浓度后除了直接影响水生生物的正常生活外还直接或间接的威胁人类健康和生产活动，因此为了保护水源和水生生态系统，利用化学方法和生态毒理学测试法进行评价。化学方法是普遍采用的一种方法但化学方法存在许多不足 4，而现有的分析手段十分有限，因此大多数污染物不能被鉴定，而
5、且也不能预测毒物之间的相互作用。 生态毒理学测试法可以弥补化学方法的不足，在一定程度上能预测毒物之间的相互作用。生态毒理学是七十年代发展起来的一门新兴的边缘科学，主要研究污染物 环境 计量三者之间的关系以及有毒物质对生物在个体、种群、群落 和生态系统水平上的毒性效应。以前毒性方面的许多研究工作是用水生态系统食物链中各代表生物如藻、蚤、鱼等进行急、慢性实验，并用这些结果作为评价环境化学物质的毒性强度及可能对生态系统造成影响的一种指标。现在这些方法很多都已做成规检测方法但它存在耗时长、花费大、只能反应对个体和群落的后期影响等问题，而发光菌的急性毒性试验能与现代光电检测手段相匹配，具有测试速度快、经
6、济、节省空间且可靠等优点而备受关注。 2、测试、研究方法举例 黄伟英，陈鸿汉，刘菲等人 5选择了苯酚、间甲基苯酚、苯胺、对硝基苯胺、硝酸铅 5 种 污染物 ,采用美国微板光度计测定了它们对发光菌青海弧菌-Q67(Vibrio-qinghaiensis sp.-Q67)的单一及联合毒性。应用非线性拟合技术模拟了这 5 种物质及其混合物的剂量 -效应曲线 ,硝酸铅可用 Logit 模型模拟 ,其它 4个物质能用 Weibull 模型准确描述 ,所有拟合相关系数在 0.98 以上 ,均方根误差在0.02 以下。根据纯物质的 EC50 值 ,获得这 5 个物质的毒性强弱顺序 :硝酸铅对硝基苯胺 间甲基
7、苯酚 苯酚 苯胺。用浓度加和 模型 (dose addition,DA)和独立作用模型 (independent action,IA)对混合物毒性进行预测。 IA 基本准确测定了这五种物质在各自 EC50 的混合毒性。 林春等人 6应用 TU、 AI、 MTI、九指数分别研究了 2， 4-二硝基甲苯与对硝基氯苯、对硝基苯胺、对硝基苯甲醚、对硝基甲苯、对硝基苯酚等剂量混合时对明亮发光杆菌的联合毒性，最后评价 2， 4-二硝基甲苯与这 5 种对位硝基苯的衍生物在等剂量混合时对发光菌的联合毒性均为协同作用 。 覃记杰、刘树深 7以淡水发光菌青海弧菌为指示生物， VeritasTM 微孔板光度计为发光
8、强度测试设备，分别测定了 8 种硝基苯类化合物及其混合物对发 光菌的发光抑制毒性。结果表明 8 种硝基苯类化合物的剂量 -效应关系都可用 Weibull模型有效描述，从模型估算的单个化合物的半数效应浓度值，可知对发光菌的毒性大小顺序为邻硝基苯胺 对硝基苯胺 对硝基苯酚 对硝基甲苯 邻硝基苯酚 间硝基苯酚 间硝基苯胺 硝基苯。按等毒性浓度比方法配制混合物进行联合毒性实验，结果表明这 8 种硝基苯类化合物对发光菌的联合毒性可用独立作用 (IA)预测，独立作用 (IA)倾向于高估了它们的联合毒性。 三、课题的研究内容及拟采取的研究方法（技术路线）、难点及预期达到的目标 1、研究内容及目标 本次研究主
9、要是通过查阅文献，收集苯酚对发光菌 Q67 的急性毒性研究的相关背景、 理论方法及实验方法，确定苯酚对发光菌 Q67 的急性毒性的影响。 （ 1）发光菌的选择及原理： 发光菌试验一般所用的明亮发光杆菌 (Photobactcrum phosphreum)8为海洋性发光细 菌，正常发光需要 3 NaCl的存在，这对海洋污染的毒性测试比较合适，而在淡水体系样品中也要加入 3 NaCl， 如此高浓度的氯离子会影响水中的一些污染物，有十分明显的局限性 。 “青海弧菌 “是科研人员于 1985年从青海湖采样获得，在 1990年 确定为一种新的淡水型发光菌，即不需要 NaCl就可以正常发光，并且该菌是全世
10、界唯一由中国学者命名的发光细菌新种 9。用 “青海弧菌 “检测环境水质，对淡水样品无需加 NaCl至 3的浓度就可以检测，而且该菌对外界有毒物质反应很灵敏 ，所以选用青海弧菌的典型菌种 Q67作为实验菌种。它在 NaCI浓度为 l 时生长最好，在 8 时为生长的上限，表明它有较高的耐高渗透压的能力，实际上它不需要 NaCI的存在即可良好发光 (对 Na+的依赖性是海洋细菌的重要特征 )。温度适应范围广， 10-35度均能发光。在 pH值为 6.5至 11范围内能生 长和发光，尤其在 pH=9左右生长和发光最佳。它的生物发光光谱峰值在484nm左右，发光峰半高宽约 90nm，发光频谱范围为 42
11、0-660nm对金鱼的感染试验表明它为非致病菌。 Thomulk10认为外来受试物通过下面两个途径抑制细菌发光： (1)直接抑制参与发光反应的酶类活性； (2)抑制细胞内与发光反应有关的代谢过程 (如细胞 呼吸等 )。发光菌是利用灵敏的光电测量系统测定毒物对发光菌发光强度的影响。实验结果显示，毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系，因而可以根据发光菌发光强度判断毒物毒性大小，用发光强度 表征毒物所在环境的急性毒性。 青海弧菌的典型菌种 Q67的 发光原理是由于活体细胞内具有 ATP、荧光素(FMN)和荧光酶等发光要素。这种发光过程是细菌体内的一种新陈代谢过程，即氧化呼吸链上的光呼吸过程。当细菌
12、合成荧光酶、荧光素、长链脂肪醛时，能发生生化反应，便产生光。生化反应如下： 基质 ATP ATP ATP 还原型辅酶 A 黄素（ H2） 细胞色素 C O2 载氢黄素单核苷酸 荧光酶（ E） O2 RCHO RCOOH E-FMNH2 E-FMNH 光 +FMN+电子 +H2O OOH 暗反应 电子 +黄素单核苷酸 +H2O2 当细胞活性高，处于积极分裂状态时，细胞 ATP含量高，发光强；休眠细胞ATP含量明显下降，发光弱；当细胞死亡， ATP立即消失，发光停止。 处于活性期的发光菌，当加入毒性物质（如 有机物、重金属、 酸、碱等），菌体就会受抑甚至死亡，体内 ATP含量也会随之降低甚至消失，
13、发光度便下降甚至到零。由于毒物浓度与菌体发光度呈线性负相关地变化，因而可根据发光度确定毒物生物毒性。若此毒物知其成份而不知其浓度，则可根据先前测得的发光度 毒物浓度关系曲线（标准曲线 ），测定浓度。 2、研究方法 配置不同浓度的苯酚溶液；将发光菌冻干粉复苏并培养成菌种 11；测定苯酚对发光菌的毒性 (EC50)数据 ；绘制其计量 -效应曲线；对计量 -效应曲线进行非线性最小二乘法模拟；得出其计量 -效应曲线的回归方程。 3、 试剂与仪器 苯酚试剂（ 分析纯 ） ; 青海弧菌 Q67冻干粉 ， 向外购买 ; DXY-2型生物毒性测试仪（ 实验室提供 ） ; THZ-C恒温振荡器 (实验室提供 )
14、; 隔水式培养箱，高压灭菌锅，比色管架 . 4、 培养液 及培养基 的配置 酵母膏 5.0g 胰蛋白胨 5.0g NaCl 30g Na2HPO4 5.0g KH2PO4 1.0g 甘油 3.0g pH 7.00.5 培养基的配置 培养液（按上述配方） 1000mL 琼脂粉 16g pH 7.00.5 5、 发光细菌冻干菌剂的复苏 及培养 选用华东师范大学生物系提供的淡水发光菌一青海弧菌 (Q67菌种 )，将装有冻干粉的安培瓶先置于 4度冰箱内约 10 15min，在超净工作台中切开安培瓶， 用1mL注射器吸取 0.5mL冷的 2%NaCl（适用于 5mL测试管）或 1mL冷的 2%NaCl（
15、适用于 2mL测试管）注 入 已开口的冻干粉安培瓶。务必充分混匀！投入置有冰块的小号（ 11.5L）保温瓶。 2分钟后菌即复苏发光 ,取已 灭菌的 O 8 NaCI溶液 100mL点在培养皿平板上，用 接种环取一环菌种蘸取点的溶液在平板上划线，倒置放于恒温培养箱中于 22度培养 24 h；挑取单个菌落接种于斜面培养基上，于 22度培养，24 h后转接于斜面，将培养好的第三代斜面置 4度冰箱中备用；将培养好的菌种接种到 15 mL液体培养基中， 22 振荡培养 15.22 h(生长至 200万以上可以使 用 )，以保证 Q67处于对数生长期。 用接种环取一环第三代斜面培养的菌种转接入盛有30mL
16、培养液的 100mL三角瓶， 20 恒温振荡培养 12h后备用。 6、 毒性测试 该实验在室内温度 20 条件操作，实验前 24h 配置待测样品储备液， 进行预实验以确定适当的浓度范围，其目的是找出发光抑制率在 50%上下时对应的浓度。具体做法是假定母液的浓度为 a，预试验的浓度范围为 0.1a， 0.01a， 0.001a。根据测定结果，找出发光抑制率在 50%上下时对应的浓度范围，接着按等对数间距用 3%NaCl 溶液稀释储备液配制数个浓度梯度，当然不同的化合物测定结果不同。而后分别取 2mL 注入具塞磨口比色管（ 1.2cm5.0cm），每个测试浓度设置三个平行对照组和一个空白对照组；取
17、 2mL 已经培养好的菌液置于盛有适量3%NaCl 溶液的三角瓶中，用磁力搅拌器强力搅拌 30min，吸取 0.5mL 菌种稀释液注入各比色管，加塞，上下强力振荡 10 次，去塞，用 DXY-2 型生物毒性测试仪测定 15min 时的发光菌发光强度 12。 7、注意事项： （ 1）菌种需定期转接，斜面、菌液等避光保存； （ 2） 发光菌法光不太稳定，因时间、温度、菌量等的变化而改变，需在稳定环境下操作； （ 3） 最好用对数生长期的菌种； （ 4） 苯酚属易挥发有机物，使用时需格外注意。 四、论文详细工作进度和安排 1. 2010.11： 由专业系队教师个人选题进行审核后对毕业生公布选题。 2
18、. 2010.12： 进行毕业论文动员，完成选题及任务书。 3. 2010.01：布置论文的具体任务， 通过查阅文献，收集研究的相关背景、理论方法及实验方法，写出文献综述、开题报告 (参考文献不少于 15篇，有外文 ) 4. 2011.02：确定实验方案并提交论文的前三项内容。 2010-2011（二）学期 5.第三教学周：完成开题报告答辩。 6.第四 十三教学周：进行毕业论文实验阶段，记录实验数据，并形成毕业论文初稿。 7.第十四教学周：对所得数据进行补充，并对初稿进行进一步的修饰，完成毕业论文的撰写。 8.第十五教学周：进行毕业答辩 答辩 五、主要参考文献 1、周启星，孔繁翔，朱琳，生态毒
19、理学 Beijing： Science Press， 2004 2 王连生有机污染物化学北京：科学出版杜， 1991,5 3 Kaiser KL E. Correlations of vibrio fischeri bacteria test data with bioassay data for other organisms J . Environmental Health Perspectives. 1998,106(2):583 591. 4 C M Lee I E Allen The ecological risk assessment of coppcr differs from
20、that of hydrophobic organic chemicals Human and Ecological Risk Assessment.1998， 4(3)： 605-617 5 黄伟英，陈鸿汉等 . 低浓度下 4 个取代苯污染物与硝酸铅的混合对发光菌的联合毒性 J. 生态环境学报 2010, 19(1): 57-62. 6 林春，康丽娟等 . 2, 4-二硝基甲苯与硝基苯衍生物对发光菌的联合毒性 J. 吉林大学学报 (理学版 ) 2003:419-422. 7 覃记杰、刘树深 .八种硝基苯类化合物对发光菌的联合毒性 J.科技园地，2007： 28-30 8 国家环境保护局水质急性毒性的测定一发光细菌法 (GB/T15441 1995) 北京；中国国家标准 1995. 9 朱文杰 ,汪杰等 . 发光细菌一新种 青海孤菌 J.海洋与湖沼， 1994,25（ 3）： 273-279. 10 黄正，王家玲发光细菌的 生理特性及其在环境监测中的应用 J环境科学， 1995， 16(003)： 87-90 11 马梅 新的生物毒性测试方法及其在水生态毒理研究所中的应用 D中国科学院生态环境研究中心 2002： 117 12 袁星 , 郎佩珍 . 应用发光菌测定有机化合物的毒性 J.环 境化学， 1994,13(3):255-258.
